comision de

investigaciones científicas de

la provincia de buenos  aires
 

 


INFORME CIENTÍFICO-TECNOLÓGICO[1]

 

PERIODO: 2001-2003.

 

                                                                                                        Legajo Nº: .........................................

 

1.       APELLIDO: Croce................................................................

NOMBRES: María .Virginia.....................................................................

 

2.       TEMA DE INVESTIGACION

 “Heterogeneidad antigénica de tumores epiteliales asociada a mucinas y la inducción de la respuesta inmune.”

 

 

3.       DATOS RELATIVOS A INGRESO Y PROMOCIONES EN LA CARRERA

INGRESO: Categoría: Adjunto con director...... Mes: ....................... Año: 1987........

ACTUAL: Categoría: .Independiente....... desde el mes:.....................Año: .1994...........

 

4.       INSTITUCION DONDE DESARROLLA LA TAREA

Nombre: Centro de Investigaciones Inmunológicas Básicas y Aplicadas (CINIBA)

 Dependencia: Facultad de Ciencias Médicas, UNLP

Dirección.Calle: .60 y 120........................................................................ Nº..............................

Ciudad:....La Plata......Pcia:.Buenos Aires..Tel:..4236711, 4241596, 4242711, int 342

Dirección electrónica:.....mvcroce@netverk.com.ar....................................................................

Cargo que ocupa:.Investigador  Independiente.............................................................

 

5.       DIRECTOR DE TRABAJOS. (En el caso que corresponda)

Apellido y Nombres: .....................................................................................................................

Dirección. Calle ............................................................................................................................

Ciudad: ................................................................... Pcia: ............................. Tel: .......................

Dirección electrónica: ...................................................................................................................

 

 

.......................................................                        ..................................................       

Firma del Director  (si corresponde)                                   Firma del Investigador

 

                                                                                  Fecha........../.........../.........

 

 

 

 

6. EXPOSICION SINTETICA DE LA LABOR REALIZADA EN EL PERIODO

El trabajo de investigación desarrollado durante el período que se informa consistió en el estudio de la expresión de mucinas y antígenos relacionados en neoplasias epiteliales benignas y malignas, en especial de mama, cabeza y cuello, estómago y colon. Se incluyeron muestras tisulares y séricas y se relacionó la presencia de los antígenos con distintos parámetros clínicos tales como localización, tamaño tumoral, presencia de ganglios comprometidos. Se emplearon diferentes anticuerpos monoclonales (AcMo). Se estudió la respuesta inmune humoral en pacientes portadoras de cáncer de mama. Por otra parte, se estudió la expresión y se realizó el aislamiento de alfa 1 glicoproteína ácida (AAG) en cáncer de colon. Los métodos empleados fueron: inmunohistoquímica, ELISA, cultivo de tejidos, mantenimiento de líneas tumorales en ratones nude, fraccionamiento subcelular mediante homogeneización y ultracentrifugación, aislamiento de glicoproteínas mediante precipitación con anticuerpos monoclonales y cromatografía de afinidad, purificación de antígenos mediante gradientes de ClCs, SDS-PAGE y Western-blotting, separación de células y de anticuerpos por partículas, análisis estadístico. Los principales resultados obtenidos fueron: 1. La determinación de diferentes epitopes peptídicos de MUC1 mediante AcMo en muestras de cáncer de mama, neoplasias benignas y normales y de cáncer de cabeza y cuello. 2. Se pudo observar que los epitopes peptídicos en pacientes con cáncer de mama se relacionaron en forma positiva y significativa entre sí y se halló una correlación negativa con edad, tamaño tumoral y porcentaje de receptores para estrógenos y progesterona. 3. Se investigó la protección que ejerce la MUC1 contra el cáncer de mama; se halló que la MUC1 induce anticuerpos anti-MUC1 libres y acomplejados en las pacientes con cáncer de mama. En el grupo control (mujeres embarazadas y en lactancia) se observó que los niveles de anticuerpos IgG e IgM inducidos por la MUC1 estaban elevados en las mujeres lactantes pero no las embarazadas. Así mismo, otro hallazgo original fue que los anticuerpos anti-MUC1 de mujeres sanas en período de lactancia reaccionaron positivamente con la MUC1 expresada por células de cáncer de mama. 4. Se detectaron células neoplásicas en la médula ósea de pacientes con cáncer de mama y estómago en diferentes estadíos de la enfermedad (aún en los primeros estadíos de diseminación) sugiriendo el escape temprano de estas células con riesgo de recidiva en los pacientes. 5. Se establecieron cultivos primarios de cáncer gástrico y de mama, y, mediante el estudio inmunohistoquímico, se hallaron similitudes antigénicas (MUC1, y antígenos hidrocarbonados asociados) con respecto a los tumores primarios. 6. Se estudió la expresión de sialil Lewis x y de sus posibles transportadores en el cáncer de colon; los resultados indicaron que los procesos malignos de colon presentan variaciones de la AAG y de sialil Lewis x; se estableció que tanto la MUC1 como la AAG podrían ser carriers de sialil Lewis x en el carcinoma colónico. 7. Se aisló la AAG a partir de muestras tisulares y séricas colónicas.

Los resultados aquí presentados constituyen evidencias de la importancia de la expresión de mucinas y antígenos hidrocarbonados en la detección temprana de las neoplasias malignas y en la inducción de una respuesta inmune anti-tumoral con evidente aplicación clínica.

Por otra parte, los estudios realizados en cáncer de mama se han realizado en el marco del programa PRECANMA, de prevención del cáncer de mama, que el CINIBA tiene con la CIC/PBA.

 

 

7. TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO REALIZADOS O  PUBLICADOS EN ESTE PERIODO

7.1. Publicaciones en revistas internacionales con referato:

 

  1. M.V. Croce, MR Price, and A. Segal-Eiras.  Association of alpha 1 acidic glycoprotein and squamous cell carcinoma of the head and neck. Pathology Oncology Research, 7, 111-117, 2001. ISSN: 1219-4956.  

Mi contribución consistió en: proposición de objetivos, recolección del material, selección de la metodología a emplear, la realización de todos los experimentos, recolección de datos de las historias clínicas, análisis de los resultados, búsqueda bibliográfica y redacción del manuscrito.

ABSTRACT

Serum from patients with different malignancies contain an abnormal concentration of a a1-acidic-glycoprotein (AAG) and also, increased levels of AAG are associated with the presence of tumor mass. In the present report, serum levels of AAG were measured by radial immunodiffusion in squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN) patients taking into account disease status parameters such as tumor localization, stage and extension of disease. Immunohistochemical methods, SDS-PAGE and Western-blotting were employed to study the expression of AAG and a carbohydrate related antigen (sialyl Lewis x) in tumor tissues and derived fractions. AAG showed abnormal levels in 7/15 oral cavity tumor patients’ sera, 2/5 oropharynx and 5/10 larynx tumors; increased AAG serum levels belonged to patients with disseminated disease. On the other hand, the presence of AAG and sialyl Lewis x were demonstrated in carcinoma cells and in derived fractions from tumor tissues belonging to patients with elevated AAG serum levels. In the present study, we have found elevated levels of AAG in serum samples from SCCHN patients; these neoplastic cells are capable to express AAG. (Pathology & Oncology Research Vol 7, No 2, 111-117, 2001).

 

  1. M.V. Croce, AG Colussi, A Zambelli, MR Price and A. Segal-Eiras. Establishment and characterization of a cell line (T201) derived from a human larynx squamous cell carcinoma. International Journal of Oncology, 18, 729-735, 2001. ISSN:1019-6439.

En este trabajo contribuí en: selección de la metodología a emplear, selección de los anticuerpos monoclonales, control de las etapas experimentales, observación de todas las inmunohistoquímicas, estudios de tumorigenicidad, análisis de los resultados, búsqueda bibliográfica y redacción del manuscrito.

ABSTRACT

The purpose of this report was the initiation and further maintenance of tumor cells from a primary larynx squamous cell carcinoma. A tumor fragment was mechanically dissociated, the cells were grown in RPMI medium, being the primary culture dependent on the presence of epidermal growth factor and insulin; during subsequent passages the adaptation to conventional growth conditions was obtained. Cells grew in monolayer with an epitheliod shape, showing a pavement-like arrangement; at confluence, cells piled up without contact inhibition maintaining the same morphology. Population doubling time was about 48 h with a colony-forming efficiency of 10%. Immunocytochemical characterization was performed with a panel of monoclonal antibodies reactive against tumor associated antigens, including mucin glycoproteins and related carbohydrate antigens, carcinoembryonic antigen (CEA), p53 as well as cytokeratins, vimentin and desmin. T201 expressed CEA, sialyl Lewis x, Lewis x, Lewis y, MUC1 mucin, Tn hapten, p53, vimentin and cytokeratins. On the other hand, a modal chromosome diploid number of 46 occurring in 74% of cells was detected. Present data confirmed that the methodology employed was adequate for the establishment and characterization of a new cell line which can provide a useful model to study biological and immunological aspects of larynx squamous cell carcinoma.

 

  1. M.V. Croce, MT Isla-Larrain, A Capafons, MR Price, A. Segal-Eiras. Humoral immune response induced by the protein core of MUC1 mucin in pregnant and healthy women. Breast Cancer Research and Treatment, 2044:1-11, 2001. ISSN 0167-6806.

En este trabajo contribuí en:proposición de los objetivos, recolección del material, selección de los anticuerpos monoclonales, control de la realización de todas las etapas experimentales, recolección de datos de las historias clínicas, análisis de los resultados , búsquedas bibliográficas y redacción del manuscrito.

ABSTRACT

Serum levels of MUC1 and antibodies (Abs) against MUC1 (IgG and IgM-MUC1) were evaluated in healthy women related to pregnancy and lactation status. A total of 149 serum samples were obtained from: nulliparous, primiparous pregnant, multiparous pregnant that have lactated, multiparous pregnant without lactation, multiparous non-pregnant actual lactating, multiparous non-pregnant that have lactated and finally, multiparous non-pregnant women without lactation. In all assays, we included pre- and post-serum samples belonging to a breast cancer patient vaccinated with a MUC1 derived peptide. CASA test was employed to measure MUC1 while IgG- and IgM-MUC1 serum Abs were evaluated with an ELISA using a 100 mer peptide as catcher. In all groups, mean IgM levels were higher than IgG mean values; when samples were grouped in pregnants versus non-pregnants, a significant difference was detected with both Abs, being raised in non-pregnants. When samples were grouped in lactating versus non-lactating a significant difference was detected with IgG-MUC1, being raised in lactating women while no significant difference was found with IgM-MUC1. The evaluation of serum MUC1 levels confirmed previous results since a significant difference between pregnant versus non-pregnant groups was found while lactating versus non-lactating samples did not. CONCLUSIONS: (i) Increased MUC1 serum levels are apparently associated with pregnancy but not with lactation; (ii) MUC1 Abs are mainly associated with lactation and with non-pregnant status. These results may be considered a contribution on studies about protection against breast cancer induced by pregnancy and lactation.

 

  1. M.V. Croce, MT Isla-Larrain, MR Price, A. Segal-Eiras. Detection of circulating mammary mucin (MUC1) and MUC1 immune complexes (MUC1-CIC) in healthy women. The International Journal of Biological Markers, 16:112-120, 2001. ISSN:0393-6155.

Mi contribución fue: proposición de objetivos, recolección del material, selección de la metodología a emplear y contribución en la puesta a punto de las técnicas empleadas, selección de los anticuerpos monoclonales, control de la realización de todas las etapas experimentales, recolección de datos de las historias clínicas, análisis de los resultados, búsquedas bibliográficas y redacción del manuscrito.

ABSTRACT

There is convincing epidemiological evidence that multiparity provides protection against the development of breast cancer. In the present study we evaluated the levels of MUC1 and MUC1 circulating immune complexes (MUC1-CIC) in 135 serum samples obtained from healthy women. The study population included 13 women who had never been pregnant, 31 primiparous pregnant women, 36 multiparous pregnant women who had lactated, 5 multiparous pregnant women who had never lactated, 24 multiparous non-pregnant women who were lactating at the time of the study, 24 multiparous non-pregnant women who had lactated, and 2 multiparous non-pregnant women who had never lactated. The purpose of this work was to detect MUC1 variations during pregnancy and lactation as well as to study the possible induction of a humoral immune response against MUC1 in these conditions. We employed ELISA techniques to measure MUC1 (CASA test) and MUC1-CIC (IgM and IgG) using two anti-MUC1 monoclonal antibodies (MAbs): C595 and SM3. Statistical analysis was performed using the ANOVA test. The pooled results pertaining to pregnant versus non-pregnant women were compared and significant differences were observed in MUC1 and MUC1-CIC-lgM levels detected with both MAbs; the MUC1-CIC-lgG levels detected with C595 were increased in the pregnant group while the MUC1-CIC-lgG levels detected with SM3 did not show any significant differences. When the results were compared between lactating and non-lactating women, no significant differences were found. In conclusion, MUC1 and MUC1-CIC-lgM, detected with both MAbs, and MUC1-CIC-4gG levels detected with the MAb C595 are apparently induced by pregnancy.

 

  1. M.V. Croce, ME Rabassa, MR Price, A. Segal-Eiras. MUC1 mucin and associated carbohydrate antigens as tumour markers in head and neck squamous cell carcinoma. Pathology Oncology Research, 7:284-291, 2001 ISSN: 1219-4956.

Mi contribución fue: proposición de objetivos,  selección de la metodología a emplear, control de la realización de todas las etapas experimentales, análisis de los resultados, búsquedas bibliográficas y redacción del manuscrito.

ABSTRACT

An immunological analysis to study MUC1 mucin core protein and carbohydrate associated antigens as tissue tumor markers in head and neck carcinoma was performed. Twenty nine patients with the following tumor localizations were included: tongue (n=10), larynx (n=8), oral cavity (n=4), maxillary sinus (n=3), tonsillar ring (n=3) and pharynx (n=1); seven samples of epithelium obtained from normal organs at the same localizations were studied as controls. Immunohistochemical analysis was performed following standard procedures and reaction was graded according to staining intensity and distribution. From each tissue section, membrane, cytoplasmic and nuclear moieties were obtained by differential centrifugation with subsequent fractionation by density gradient centrifugation (6M guanidium chloride-CsCl); subcellular moieties and CsCl derived fractions were analyzed by immunoblotting. Monoclonal antibodies (MAbs) reacting with the core protein of MUCI (C595) and associated carbohydrate antigens were: Tn, 83D4 MAb; Lewis y antigen (Le y), C14 MAb; Lewis x antigen (Le x), KM380 MAb and sialyl Lewis x (sLe x), KM93 MAb. Statistical analysis was undertaken by Spearman rank correlation. In tumor samples, the immunohistochemical identification of MUCl core protein and associated antigens was extended; differences were found in the pattern and intensity of expression; results were corroborated by immunoblotting although in a few samples there was not coincidence between both methods. Localization, tumor mass or node involvement did not show significant differences for any of the antigens studied. Conclusions: 1) head and neck carcinoma expressed MUCI and associated carbohydrate antigens in high levels; 2) no relationship between antigenic expression and tumor status was found. (Pathology & Oncology Research Vol 7, No 4, 284-291, 2001).

 

  1. M. V. Croce and A. Segal-Eiras The use of carbohydrate antigens for the preparation of vaccines for therapy in breast cancer. Drugs of Today, 38:759-768, 2002. ISSN 0025-7656.

Este trabajo se realizó por invitación del Comité Editor de la revista. Mi contribución fue: proposición de objetivos, análisis de datos, búsquedas bibliográficas y redacción del manuscrito.

ABSTRACT

Immunotherapy of human breast cancer is a rapidly growing experimental area based on peptidic as well as carbohydrate tumor associated antigens. Cell surfaces carbohydrates are characteristics of different stages of normal development and differentiation; distinct carbohydrates are expressed in tissue- and cell- specific manners during those processes. Under pathological conditions such as neoplasia, changes in carbohydrate structures can be present almost always. In the successful development of carbohydrate anticancer vaccines, adjuvant and carrier molecules which promote the presentation of an antigen to the immune effector cells, are clue factors. At present, keyhole limpet hemocyanin (KLH) is the most widely used carrier protein in cancer immunotherapy and QS-21 is the adjuvant widely employed. In breast cancer, the immunogenicity of TF, Tn, sTn and Globo H antigens has been explored in different clinical trials. Approaches including vaccines against sialyl-Tn (STn) and globo H are presently assayed with expectancy. From the experience obtained, it is possible to conclude that: (1) the employment of glycolipopeptide with clustered epitopes which seem to be more effective than related structures with single epitopes to induce antitumor cell antibodies; (2) the need of conjugation to carriers being KLH the best; (3) the use of totally synthetic constructs can be better immunogens in conjunction with a suitable adjuvant such as QS-21; in some cases, this adjuvant leads to bypass the need for specific T-cell help to stimulate IgG as well as IgM antibodies while in some others, a T-cell mediated immune response is obtained and (4) the development of a totally synthetic vaccine would greatly facilitate the production of the vaccine for large scale clinical trials with the attainment of regulatory approval.

 

  1. M. V. Croce, M. Isla-Larrain, C. Rua, M. Rabassa, S. Gendler, A. Segal-Eiras. Patterns of MUC1 expression defined by an anticytoplasmic tail monoclonal antibody in breast cancer. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 51:781-788, 2003. ISSN:0022-1554.

Mi contribución fue: proposición de objetivos,  selección de la metodología a emplear, control de la realización de todas las etapas experimentales, análisis de los resultados, búsquedas bibliográficas y redacción del manuscrito.

ABSTRACT

Our aim was to determine the pattern of expression of MUC1 mucin cytoplasmic tail (MUC1 CT) in breast carcinoma. A total of 98 invasive breast adenocarcinoma tumor samples were assayed by immunohistochemical (IHC) analysis. The pattern of reaction was classified as membrane, cytoplasmic, or mixed. Subcellular fractions were prepared after SDS-PAGE and Western blotting. The antibodies employed were anti-MUC1 CT (CT2 monoclonal antibody, MAb) and C595 MAb against the extracellular MUC1 core protein. With the CT2 MAb, IHC showed a high percentage of positive staining in 93% of specimens, with membrane staining the most common pattern observed. C595 MAb was reactive in 73% of specimens. Similar percentages of membrane and cytoplasmic staining were found, mainly in a mixed pattern. Western blotting showed different bands. With the CT2 MAb, the membrane fraction showed the most intense reaction; a strong band of reaction was detected at approximately <30 kD. With the C595 MAb, in most cases a double band at 200 kD was found. In breast epithelium, the pattern of MUC1 CT expression may constitute an indicator of MUC1 production because it does not depend on glycosylation. The pattern and extension of MUC1 CT positivity do not vary according to the histopathological subtype of the tumor. (J Histochem Cytochem 51:781-788, 2003)

 

Resúmenes de Presentaciones en congresos publicadas en revistas internacionales:

 

1. Tissue and serum MUC1 detection in breast cancer

MV Croce, M T Isla-Larrain, A Capafons, G Patrizzi, J Gori, C Sala., Segal-Eiras A

International Journal of Molecular Medicine, 8 suppl 1, S38, 2001

 

2. Identification of MUC1 mucin core protein and associated carbohydrate antigens in head and neck carcinoma.

MV Croce,  ME Rabassa, A Pereyra, C Pereyra, Segal-Eiras A

International Journal of Molecular Medicine, 8 suppl 1, S38, 2001

 

3. Expression of tumour associated antigens in colorectal cancer

Croce MV, Colussi AG, E Adjigogovic, Segal-Eiras A

European Journal of Cancer, 37 suppl 6, S303, 2001

 

4. Identificación de antígenos asociados a la mucina polimórfica epitelial de tipo 1 (MUC1) en el carcinoma de cabeza y cuello.

MV Croce,  ME Rabassa, A Pereyra, C Pereyra, Segal-Eiras A

Medicina 61, 5/2,:682, 2001.

 

5. Determinación de los antígenos asociados a tumor en el adenocarcinoma y lesiones benignas del colon.

Croce MV, Colussi AG, E Adjigogovic, Segal-Eiras A

Medicina 61, 5/2, :735, 2001.

 

6. Detección de mucina 1 (MUC1) circulante y en el tejido tumoral de pacientes con cáncer de mama.

MV Croce, M T Isla-Larrain, A Capafons, J Gori, C Sala., A Segal-Eiras.

Medicina 61, 5/2, :682, 2001.

 

7. Antigens of peptidic and carbohydrate nature expressed by breast cancer tissues and benign counterparts.

MV Croce, M T Isla-Larrain, A Capafons,C Rua, J Gori, MR Price, A Segal-Eiras

European Journal of Cancer S3, S56, 2002.

 

8.      Determinación de diferentes variantes de mucina tipo 1 (MUC1) en el cáncer de mama. MV Croce, Rabassa M, Sálice V, Segal-Eiras, A. Medicina 62 (5):492, 2002.

 

9.      Relación entre los diferentes factores de riesgo con los antígenos asociados a mucina tipo 1 (MUC1) en cáncer de mama. MV Croce, Isla-Larrain M, Rua C, Demichelis S, Gori J, Segal-Eiras, A. Medicina 62 (5):492, 2002.

 

10.  Aislamiento de alfa 1 glicoproteína ácida (AGP) en carcinoma colorrectal. MV Croce, Sálice V, Segal-Eiras, A. Medicina 62 (5):493, 2002.

 

7.2. Trabajos en prensa y/o aceptados para su publicación: no corresponde

 

7.3. Trabajos enviados y aun no aceptados para su publicación

7.3.1.      M. V. Croce, M. Isla-Larrain, Sandra Demichelis, Jorge Gori , Mike R. Price and A. Segal-Eiras. Tissue and serum MUC1 detection in breast cancer patients. Breast Cancer Research and Treatment, 2003.

Mi contribución fue: proposición de objetivos,  obtención del material, recolección de datos de las historias clínicas, selección de la metodología a emplear, control de la realización de todas las etapas experimentales, análisis de los resultados, búsquedas bibliográficas y redacción del manuscrito.

ABSTRACT

Tumor MUC1 expression as well as levels of MUC1, MUC1 circulating immune complexes (MUC1-CIC) and free antibodies against MUC1 (IgG and IgM-MUC1) were evaluated in 70 breast cancer patients with different stages of disease. Controls included: 135 serum samples from healthy women, normal mammary tissue samples (n=7) and benign breast disease specimens (n=6). Serum MUC1 was measured through Cancer Associated Serum Antigen test and CA15-3 test. Employing ELISA, MUC1-CIC-IgG/M were measured with either C595 or SM3 monoclonal antibodies (MAb) as catchers and also free antibodies against MUC1 (IgG and IgM) using 100mer peptide as catcher. Employing multivariate statistical analysis, results were correlated with age, tumor type, stage of disease and grade of differentiation. By quantitative immunohistochemistry using three anti-MUC1 core protein MAbs (C595, HMFG2 and SM3), tumor MUC1 was detected in 60/70 breast cancer specimens which reacted with at least one of these MAbs. High MUC1 serum levels were detected in 14/67 (21%); IgG and IgM anti MUC1 antibodies were found elevated in 32% and 14%, respectively while IgG-MUC1-CIC- measured with C595 in 42% and IgM-MUC1-CIC in 54%; finally, SM3 was positive in 43% and 18%, respectively. Conclusions: 1- MUC1 is highly expressed in breast carcinoma although only in a few patients, both MUC1 tissue and serum expression were found 2- Breast cancer cells express different MUC1 glycoforms defined by immunohistochemical analysis and 3- Serum MUC1 can circulate free or complex with IgG and IgM antibodies; thus an accurate measurement should include both forms.

7. 4: no corresponde

7.5:  ver 13

7. 6: no corresponde

8. no corresponde

9.no corresponde

 

  1. PUBLICACIONES Y DESARROLLOS EN

 

10.1. DOCENCIA: Capítulo de libro. Tema: “Introducción a la Inmunología” parte II para la maestría de “Fisiopatología Endocrina: Bioquímica y Métodos diagnósticos”, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP y Comisión Nacional de Energía atómica, Bs.As. Autores: Amada Segal-Eiras y María Virginia Croce.

10.2. no corresponde

 

11. DIRECCIÓN DE BECARIOS Y/O INVESTIGADORES

Méd. Rabassa, Martín Enrique. Beca de Iniciación CIC/PBA 2000-2002. Codirectora. Directora: Prof Dra Amada Segal-Eiras. Tema: “Caracterización inmunológica de las mucinas expresadas por tumores de epitelios malignos.” 

Méd. Rabassa, Martín Enrique: Beca de Perfeccionamiento CICPBA: 2002- Codirectora. Directora: Prof Dra Amada Segal-Eiras. Tema: “Estudio de las mucinas y de sus antígenos asociados expresados por los tumores malignos y su relación con la inducción de respuesta inmune”.

Sálice, Viviana: Beca Post-Doctoral, CONICET 2001-2002. Codirectora. Directora: Prof Dra Amada Segal-Eiras. Tema: “Expresión de mucinas y antígenos asociados en cáncer de mama.”

Méd. Patrizzi, Gustavo Luis. Beca de Entrenamiento de UNLP.1999-2001. Codirectora. Directora: Prof Dra Amada Segal-Eiras. Tema: “Expresión de mucinas y antígenos asociados en cáncer de mama”.

Lic. Lacunza,  Ezequiel: Beca de Iniciación UNLP: 2002- Codirectora. Directora: Prof Dra Amada Segal-Eiras. Tema: “Estudio de los antígenos hidrocarbonados en tumores epiteliales malignos y su relación con la progresión de la enfermedad.”

 

12. DIRECCIÓN DE TESIS

Méd. Rabassa, Martín Enrique. Tesis de doctorado a la carrera de Doctor en Ciencias Médicas, Fac,. de Ciencias Médicas, UNLP. Codirectora. Directora: Prof Dra Amada Segal-Eiras. Tema: “estudio de las mucinas polimórficas epiteliales asociadas a tumores malignos.”

 

13. PARTICIPACIONES EN REUNIONES CIENTÍFICAS

 

Trabajos presentados:

 

1. Tissue and serum MUC1 detection in breast cancer.

M Croce, MT Isla‑Larrain, A Capafons, G Patrizzi, J Gori, C Sala, A Segal‑Eiras

6th World Congress on Advances in Oncology and 4th International Symposium on Molecular Medicine, Creta, Grecia, 2001

disertante

 

2. Identification of MUC1 mucin core protein and associated carbohydrate antigens in head and neck carcinoma.

MV Croce, ME Rabassa, C Pereyra, A Pereyra, A Segal‑Eiras.

6th World Congress on Advances in Oncology and 4th International Symposium on Molecular Medicine, Creta, Grecia, 2001

disertante

 

3. Expression of tumour associated antigens in colorectal cancer.

MV Croce, AG Colussi, E Adjigogogic, A Segal‑Eiras.

ECCO 11,The European Cancer Conference, Lisboa, 2001

Coautor

 

4. Expresión de mucinas asociadas a tumor en neoplasias malignas de cabeza y cuello.

MV Croce, ME Rabassa, C Pereyra, A Pereyra, A Segal‑Eiras.

XLVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clinica y XLIX de la Sociedad Argentina de Inmunologia, Mar del Plata, 2001

Coautor

 

5. Detección de mucina 1 (MUC1) circulante y en el tejido tumoral de pacientes con cáncer de mama.

MV Croce,  M Isla-Larrain, A Capafons, J Gori, C Sala, A Segal-Eiras.

XLVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clinica y XLIX de la Sociedad Argentina de Inmunología, Mar del Plata, 2001

Coautor

 

6. Determinación de los antígenos asociados a tumor en el adenocarcinoma y lesiones benignas del colon.

MV Croce, AG Colussi, E Adjigogogic, A Segal‑Eiras.

XLVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clinica y XLIX de la Sociedad Argentina de Inmunología, Mar del Plata, 2001

Couator

 

7. Antigens of peptidic and carbohydrate nature expressed by breast cancer tissues and malignant counterparts.

MV Croce, M Isla-Larrain, A Capafons, C Rua, J Gori, MR Price and Segal-Eiras A.

Third European Breast Cancer Conference, Barcelona, 2002

Coautor

 

8. Relationship among different risk factors and MUC1 related antigens expressed by breast cancer.

MV Croce, M Isla-Larrain, C Rua, S DeMichelis, J Gori, and Segal-Eiras A.

Fourth Milan Breast Cancer Conference, Milán, 2002.

Coautor

 

9. Avances en la determinación de marcadores tisulares en el adenocarcinoma colorrectal.

G Ramacciotti,  MV Croce, A Colussi, N Chopita, A Bernedo, A Jmelnitsky, M Canestri, J Cheli, A Segal-Eiras.

Congreso Argentino de Gastroenterología, Buenos Aires, 2002

Coautor

 

10. Growth and immunologic characteristics of a human lung adenocarcinoma xenografted in athymic nude mice.

Croce MV, Colussi AG, Carriquiriborde M, Carbone C, Segal-Eiras A

53rd AALAS National Meeting, San Antonio, Texas, Estados Unidos, 2002

Coautor

 

11 Human breast carcinoma xenografted tumor and their metastatic implants in athymic nude mice: a comparative study.

 Croce MV, Colussi AG, Laborde JM, Carbone C, Segal-Eiras A.

53rd AALAS National Meeting, San Antonio, Texas, Estados Unidos, 2002

Coautor

 

12. Determinación de diferentes variantes de mucina tipo 1 (MUC1) en el cáncer de mama.

Croce MV, Rabassa ME, Sálice V, Segal-Eiras.

L Reunión Científica de la SAI y XLVII Reunión Científica de la SAIC, Mar del Plata, 2002.

Coautor

 

13. Relación entre diferentes factores de riesgo con los antígenos asociados a mucina tipo 1 (MUC1) en el cáncer de mama.

Croce MV, Isla-Larrain M, Rua C, Demichelis S, Segal-Eiras.

L Reunión Científica de la SAI y XLVII Reunión Científica de la SAIC, Mar del Plata, 2002.

Coautor

 

14. Aislamiento de alfa 1 glicoproteína ácida (AGP) en carcinoma colorrectal

Croce MV, Sálice V, Segal-Eiras.

L Reunión Científica de la SAI y XLVII Reunión Científica de la SAIC, Mar del Plata, 2002.

Coautor

 

15. Advances in the determination of tumor markers in colorectal carcinoma.

Croce MV, Colussi, AG, Ramacciotti G,  Segal-Eiras A.

6to. Congreso Latinoamericano de Inmunología y 3er Congreso Cubano de Inmunología, La Habana, 2002.

Coautor

 

16. Patterns of MUC1 tissue expresión defined by an anti MUC1 cytoplasmic tail monoclonal antibody in breast cancer.

Croce MV, Isla-Larrain M, Rua C, Rabassa ME, Segal-Eiras A.

6to. Congreso Latinoamericano de Inmunología y 3er Congreso Cubano de Inmunología , La Habana, 2002.

Coautor

 

17. Expression of peptidic antigens in breast cancer.

Croce MV, Isla-Larrain M, Rua C, Segal-Eiras A.

6to. Congreso Latinoamericano de Inmunología y 3er Congreso Cubano de Inmunología, La Habana, 2002.

Coautor

 

14. no corresponde

 

15. SUBSIDIOS RECIBIDOS EN EL PERÍODO

 

15.1. CONICET: PIP No.4718; Título: “Estudio de las mucinas polimórficas epiteliales asociadas a neoplasias humanas.”

 

15.2. BID-CONICET: No. 05-06544:  “Relación entre la presencia de células de cáncer de mama en médula ósea y la respuesta inmune anti-tumoral.”

 

16. DISTINCIONES O PREMIOS OBTENIDOS EN EL PERIODO

 

Premio al mejor trabajo en Investigación Médica (experimental) “Adolfo H. Aztiria” año 2002 otorgado por la Academia Nacional de Medicina.

Tema: “Investigación de la mucina de tipo 1 (MUC1) circulante y tisular en el cáncer de mama.”

Autores: María Virginia Croce, Marina Isla-Larrain, Andrea G Colussi, Jorge R. Gori y Amada Segal-Eiras.

 

17. no corresponde.

 

 

18.TAREAS DOCENTES DESARROLLADAS EN EL PERIODO

 

18.1. Ayudante Diplomado simple con extensión de la dedicación a exclusiva (en el marco de los Incentivos), Cátedra de Fisiología Humana, Facultad de Ciencias Exactas (UNLP), licencia sin goce de haberes a partir de diciembre de 2001.

8 horas semanales

 

18.2. Jefe de Trabajos Prácticos exclusiva, Cátedra de Histología, Facultad de Ciencias Médicas (UNLP), a partir de diciembre de 2001.

8 horas semanales

 

18.3. Coordinador y Docente del Módulo de Patología, Maestría en Ciencias del Laboratorio Clínico, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, año 2002. Se dicta una vez por año.

 

18. OTROS ELEMENTOS DE JUICIO NO CONTEMPLADOS EN LOS TITULOS ANTERIORES

 

20. TITULO Y PLAN DE TRABAJO A REALIZAR EN EL PROXIMO PERIODO.

TITULO: “Estudio de los antígenos peptídicos e hidrocarbonados asociados a mucinas polimórficas epiteliales en tumores malignos de histogénesis epitelial.”

INTRODUCCIÓN

La aparición, crecimiento y diseminación de un tumor maligno es un complejo proceso que requiere de un conjunto de moléculas que, hasta el presente, sólo se han identificado parcialmente (Nicolson 1987, Putz 1999). Debido a ello, la investigación de estas moléculas constituye un tema de gran interés y actualidad.

Las mucinas epiteliales son glicoproteínas que han sido relacionadas tanto con la carcinogénesis como con la diseminación tumoral y se las identifica con un número (Taylor-Papadimitriou y Finn, 1997). Las células tumorales pueden sobreexpresar o expresar en forma alterada las mucinas de sus contrapartidas normales o bien, algunos tumores, adquieren la capacidad de expresar mucinas diferentes a los epitelios normales en los que se originan.

La MUC1 es la más extensamente estudiada hasta el presente; su expresión en las células de cáncer de mama y cabeza y cuello, por ejemplo, difiere de la de los epitelios normales; estas diferencias se encuentran fundamentalmente en las cadenas hidrocarbonadas laterales lo que determina que puedan ser  inmunogénicas y se la considera dentro del grupo de los antígenos asociados a tumor (Finn et al, 1995). La MUC1 se ha hallado elevada en el suero de pacientes con cáncer de mama en estadíos avanzados de la enfermedad neoplásica y constituye un marcador tumoral (McGuckin et al, 1995). Otras mucinas neoplásicas también difieren de su contrapartidas normales en la glicosilación (Taylor-Papadimitriou y Finn, 1997).; en el cáncer gástrico, por ejemplo, la MUC2 es sintetizada por células que normalmente no lo hacen.

La detección temprana de las enfermedades neoplásicas así como el develamiento de los mecanismos de invasión y metástasis constituyen objetivos fundamentales de la Oncoinmunología porque pueden posibilitar, por un lado, la curación total del paciente y por otro, prevenir la diseminación. Las mucinas epiteliales y sus antígenos hidrocarbonados asociados pueden constituir herramientas útiles para lograr ambos objetivos.

Por otra parte, los estudios realizados en cáncer de mama se continuarán realizando en el marco del programa PRECANMA, de prevención del cáncer de mama, que el CINIBA tiene con la CIC/PBA.

OBJETIVOS

1.      Detectar mucinas y antígenos hidrocarbonados asociados en el suero de pacientes con carcinoma y controles en diferentes estadíos de la enfermedad neoplásica.

2.      Estudiar la respuesta inmune humoral inducida por las mucinas y antígenos hidrocarbonados en pacientes con cáncer y controles.

3.      Relacionar la respuesta inmune anti-tumor con la evolución de la enfermedad.

4.      Relacionar los niveles de mucinas, antígenos hidrocarbonados y anticuerpos específicos con parámetros clínicos tales como localización, diseminación, diagnóstico histopatológico antecedentes personales y familiares.

5.      Aislar células tumorales de médula ósea en pacientes con distintos estadíos de la enfermedad.

6.      Relacionar la presencia (o no) de células tumorales en la médula ósea con parámetros clínicos y con la respuesta humoral anti-tumoral.

7.      Establecer cultivos primarios de tumores malignos y de células neoplásicas de médula ósea y sangre periférica.

8.      Estudiar la expresión de mucinas y antígenos hidrocarbonados asociados en neoplasias benignas y malignas y células aisladas de médula ósea.

9.      Comparar la expresión de mucinas y antígenos asociados en tumores epiteliales localizados en diferentes órganos.

10.  Relacionar la expresión de mucinas y antígenos hidrocarbonados asociados con los procesos de invasión y metástasis.

MATERIALES

a. Muestras séricas de pacientes con neoplasias de distinta localización y distintos estadíos tumorales: cáncer in situ, carcinoma invasor, metástasis locales y a distancia y patologías benignas de la misma localización tumoral para medir mucinas y antígenos asociados así como anticuerpos específicos libres y acomplejados.

b. Tejidos tumorales de distinta localización para diagnóstico histopatológico, fraccionamiento subcelula, inmunohistoquímica y cultivo celular

c. Líneas de cultivo celular establecidas provenientes de tumores de diversa histogénesis.

d. Extendidos de médula ósea de pacientes con neoplasias con cáncer de mama y gástrico.

e. Anticuerpos monoclonales específicos para antígenos tumorales y citoqueratinas.

f. Ratones nude para inyectar tumores, mantener líneas tumorales in vivo y realizar estudios de diseminación tumoral.

METODOS

1- Inmunohistoquímica e inmunocitoquímica (Osako et al, 1993).

2- Fraccionamiento subcelular de tumores mediante homogeneización y centrifugación a alta velocidad.

3- Purificación antigénica mediante centrifugación en gradientes de Cloruro de Cesio (Creeth et al, 1970; Croce et al, 2000).

4- Análisis de las distintas fracciones mediante Electroforesis unidimensional en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970) e inmunoblotting (Towbin et al, 1979).

5- Cultivo de tumores primarios (Croce et al, 1998).

6- Mantenimiento de tumores primarios en ratones nude.

7- Separación de subpoblaciones celulares de líneas tumorales establecidas mantenidas in vitro. (Restnicoff et el, 1987, Croce et al, 1999).

8- Enzimoinmunoensayo para la detección de MUC1 libre empleando el test de CASA (cancer associated serum antigen) (Mc Guckin et al, 1995).

9- Enzimoinmunoensayo para la detección de anticuerpos libres y unidos a antígenos formando complejos inmunes (Gouretvich et al, 1995, Richards et al, 1999, Croce et al 2001) en el suero de pacientes y controles.

10- Separación de células y de anticuerpos por  partículas inmunomagnéticas.

11- Preparación de spots de células tumorales de médula ósea previamente separadas mediante partículas inmunomagnéticas las que serán empleadas para inmunohistoquímica.

12- Análisis de datos por métodos estadísticos con análisis de correlación múltiple, entre otros.

 

BIBLIOGRAFÍA

Creeth JM, Denborough MA. The use of equilibrium-density-gradient methods for the preparation and characterization of blood-group-specific glycoproteins. Biochem J 1970; 117(5):879-91.

Croce MV, Colussi AG,  Segal-Eiras A. Assessment of methods for primary tissue culture of human breast epithelia. J Exp Clin Cancer Res 1998; 17:19-26.

Croce MV, Colussi AG, Price MR, Segal-Eiras A. Identification and characterization of different subpopulations in a human lung adenocarcinoma cell line (A549). Pathol Oncol Res 1999; 5(3):197-204.

Croce MV, Price MR, Segal-Eiras A. Detection and isolation of MUC1 mucin from larynx squamous cell carcinoma. Pathol Oncol Res 2000 6:93-99.

Croce MV, Isla-Larrain MT, Price MR, Segal-Eiras A. Detection of circulating mammary mucin (MUC1) and MUC1-immune complexes (MUC1-CIC) in healthy women. Int J Biol Markers 2001, 16, 112-120, 2001.

Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines. Immunol Rev 1995; 145:61-89.

Gouretvich M, von Mensdorff-Pouilly S, Litvinov S.Polymorphic epithelial mucin (MUC-1)-containing circulating immune complexes in carcinoma patients. Br.J. Cancer 1995; 72,:934-938.

Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227:680-5.

McGuckin MA, Walsh M, Hohn B Prognostic significance of MUC1 epithelial mucin expression in breast cancer. Hum Pathol 1995; 26:432-439.

Nicolson Nicolson G. Tumor cell instability, diversification and progression to the metastatic phenotype: from oncogene to oncofetal expression. Cancer Res., 47:1473-1487, 1987.

Osako M, Yonezawa S, Siddiki B Immunohistochemical study of mucin carbohydrates and core proteins in human pancreatic  tumours. Cancer 1993; 71:2191-2199

Putz E, Witter K, Offner S, Stosiek P, Zippelius A, Johnson J, Zahn R, Riethmüller G, Pantel K. Phenotypic characteristics of cell lines derived from disseminated cancer cells in bone marrow of patients with solid epithelial tumors: establishment of working models for human micrometastases. Cancer res 59:241-248, 1999.

Restnicoff M, Medrano EE, Podhajcer O, Bravo A, Bover L, Mordoh J. Subpopulations of MCF7 cells separated by percoll gradient centrifugation: a model to analize the heterogeneity of human breast cancer. Proc Natl Acad sci USA 1997; 84: 7295-7299.

Richards ER, Devine P, Quin R, Darrell Fontenot J, Ward B, McGuckin M. Antibodies reactive with the protein core of MUC1 mucin are present in ovarian cancer patients and healthy women. Cancer Immunol Immunother 1999; 46: 245-252.

Taylor-Papadimitriou J, Finn OJ. Biology, biochemistry and immunology of carcinoma-associated mucins. Immunol Today 1997; 18(3):105-7.

Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A 1979; 76(9):4350-4.


[1] Art. 11; Inc. “e” ; Ley 9688 (Carrera del Investigador Científico y Tecnológico)