Legajo Nº 206 C.I.
1.
APELLIDO GODOY
Nombres Héctor Manuel
2.- TEMAS DE INVESTIGACIÓN
A.
Toxicidad de componentes de alimentos, forrajes, etc., para el ganado y
animales domésticos.
B.
Evaluación de actividad biológica en plantas autóctonas de la República
Argentina.
3.- DATOS RELATIVOS A INGRESO Y PROMOCIONES EN LA CARRERA.-
INGRESO:
Categoría Adjunto Sin Director
Octubre 1982
ACTUAL :
Categoría Independiente
Enero 1991
4.- INSTITUCIÓN DONDE
DESARROLLA LA TAREA
Nombre: INTA - Centro Nacional de Investigaciones
Agropecuarias
Dependencia: Instituto de Patobiología.
Dirección. Calle:
Casilla de Correo 77
C.P. 1708
Ciudad: Morón -
Pcia: Buenos Aires Tel: 4621-1289 – Tel/Fax 4621-1712
Dirección electrónica: hgodoy@cnia.inta.gov.ar
Cargo: Jefe
del Laboratorio de Toxicología
6. EXPOSICIÓN SINTÉTICA DE LA LABOR
DESARROLLADA EN EL PERÍODO.-
6.1.
Introducción.-
Creo
que no hacen falta extensos comentarios sobre los hechos ocurridos en el año
2001 y sus consecuencias posteriores, porque estoy seguro que nos afectó a
todos por igual. A pesar de
todo, nuestro Laboratorio pudo mantener un buen nivel de actividad gracias a
previsiones que habíamos adoptado en años anteriores, donde habíamos realizado
un importante acopio de reactivos y materiales de trabajo.
Durante el presente período continuamos
trabajando en forma paralela sobre las 2 líneas de acción que describí en
informes anteriores. Por un lado, continuamos el Proyecto de Investigación
Plurianual financiado por CONICET, y continuamos investigando problemas de
toxicidad del ganado: la neurotoxicidad producida por Condalia (piquillín), y la posible toxicidad del Lolium multiflorum (raigrás
anual) infectado con un hongo endófito. Por otro lado, continuamos realizando
investigaciones aplicadas en carácter de apoyo tecnológico a empresas y a
productores del sector agroalimentario, una actividad fuertemente apoyada por
el INTA.
6.2. Estudio sobre bioactividad de plantas
autóctonas (PIP CONICET 4197)
Si bien el CONICET recién efectivizó los
fondos para el 3er año a fines del 2002, nosotros continuamos el
trabajo sin interrupción. A esta altura ya hemos evaluado la actividad de
extractos de 120 especies de plantas nativas contra microorganismos patógenos Grampositivos y Gramnegativos, contra
hongos filamentosos y contra Mycobacterium tuberculosis. De todos los
extractos que tuvieron alguna actividad antimicrobiana, hemos seleccionado los
20 que parecen tener mayor potencia, para realizar los estudios de aislamiento
e identificación de los componentes activos. En estos momentos ya hemos logrado
cristalizar un producto activo que inhibe el Staphylococcus y el Mycobacterium.
En
la Carpeta de Documentación Respaldatoria hemos incorporado una descripción de
los resultados obtenidos con Mycobacterium y con hongos filamentosos,
que todavía no han sido publicados.
6.3.
Estudios sobre toxicidad de Condalia megacarpa. (Mal del
piquillín).
Para estar en condiciones de realizar un estudio químico sobre la
corteza de piquillín, con el propósito de identificar el agente causal de la
toxicidad, comenzamos un estudio con animales de laboratorio. Logramos
reproducir el síndrome neurológico mezclando CP molida con el alimento de los
animales. Los síntomas son similares a los que desarrollan los rumiantes, en
tanto y en cuanto lo primero que se ve afectado son las extremidades traseras.
Avanzando un poco más, preparamos extractos de la CP en metanol/diclorometano,
seguido por un lavado con agua, y comprobamos que el componente tóxico se
encuentra en la fracción orgánica, pero hasta el momento sólo ha sido posible
reproducir la toxicidad si el extracto se mezcla con el alimento. Por vía
intraperitoneal se observa una sintomatología compatible con una depresión del
sistema nervioso central: los animales entran lentamente en coma y al cabo de 2
o 3 días mueren. Este cuadro es sustancialmente diferente del producido por el
piquillín "a campo", de modo que, en tanto no dispongamos de otro
bioensayo, tendremos que seguir utilizando la vía oral, mezclando los extractos
con el alimento.
6.4. Evaluación de la eficacia de un formulado
fumígeno antifúngico para tratamiento de silos destinados a alimento para
animales de granja.
La
empresa Janssen-Cilag Farmacéutica S.A., a través de su División de Salud Animal,
recurrió a nuestro Laboratorio para proponernos la realización de diversos
ensayos para evaluar la efectividad de un producto fumígeno antifúngico que
ellos comercializan, como agente preventivo de la formación de micotoxinas en
silos destinados al almacenamiento de alimento para animales. Luego de discutir con el
Director Técnico de la Empresa los pros y contras del tratamiento propuesto,
ellos nos pidieron que redactáramos un proyecto para realizar la evaluación. El
proyecto que presentamos fue revisado por el Departamento Científico de la
empresa matriz, ubicada en Bélgica, que dio el visto bueno para su realización.
El estudio se llevó a cabo en la segunda mitad del 2002. Se pudo constatar que
el producto
ensayado inhibe totalmente el crecimiento vegetativo de los hongos en un medio
de cultivo, pero sólo actúa parcialmente sobre los conidios "secos",
que mantienen su capacidad de germinación cuando se los coloca en un medio
apropiado. Ante estos resultados, decidimos realizar por nuestra cuenta un ensayo
complementario, con una metodología diferente. Así pudimos demostrar que las
esporas tratadas con el fumígeno antifúngico están inhibidas in situ
alrededor de un 99 %, pero esa inhibición desaparece cuando las esporas son
suspendidas en agua y luego sembradas sobre un medio apropiado.
En la Carpeta de Documentación
Respaldatoria se agrega una descripción detallada del proyecto y los Informes
con los resultados. Un resumen de los
mismos se puede ver en las Secciones 7.6.2. y 7.6.3.
6.5.
Efectos beneficiosos de taninos de quebracho (TQ) en rumiantes.
A mediados del
año 2001 se realizó un ensayo en un tambo comercial, comparando los parámetros
productivos en animales controles y tratados (con agregado de TQ a la dieta).
Este estudio fue culminación de los trabajos previos que habíamos realizado a
nivel laboratorio y tambo piloto, y su resultado fue exitoso. En estos momentos
la Empresa ya está comercializando una forma del producto apta para su agregado
como aditivo al alimento para bovinos de leche. Adicionalmente, a mediados del
2002 se comenzó otro estudio "a campo" para verificar la acción
preventiva de los TQ contra el timpanismo bovino. Los TQ se agregaron
directamente a los bebederos de los animales. El resultado también fue exitoso.
Hace poco tiempo la Empresa nos comunicó que, en principio, podría
autorizar la publicación de parte de los trabajos que hicimos en la etapa
inicial de este estudio, siempre y cuando mantengamos en reserva el origen del
producto. En estos momentos estamos traduciendo los trabajos al inglés, para
enviarlos a una revista internacional. En principio, se redactarán 2
comunicaciones, cuyos Abstracts se pueden ver en las secciones 7.4.2. y
7.4.3.
Una copia en
papel de los métodos y los resultados se puede hallar en la Carpeta de
Documentación Respaldatoria, para facilitar su consulta (ya se habían incorporado a los Informes
anteriores).
6.6. Datos
epidemiológicos sobre posible toxicidad del Lolium multiflorum infectado
con un hongo endófito.
Como
informamos anteriormente, en varios haras de nuestro país sigue teniendo
vigencia la creencia de que el raigrás anual de diversa procedencia, que muy
frecuentemente se encuentra contaminado con un hongo endófito, puede producir
trastornos reproductivos en yeguas. Nuestro Laboratorio continúa acopiando
datos en forma prospectiva, correlacionando la presencia de dicho hongo
con la aparición de síntomas. En el año 2002 visitamos un haras de la Provincia
de Buenos Aires donde habían ocurrido abortos, pero pudimos comprobar que no
tenían relación con el pasto. Hasta el momento, después de analizar más de 50
muestras de pasto, detectamos hongo endófito en casi el 90 %, pero en ningún
caso pudimos detectar ergovalina, ni confirmar una acción tóxica de esos
pastos. Sin embargo, no se puede extraer una conclusión definida, porque
comúnmente en los establecimientos involucrados las yeguas preñadas son
retiradas de esos potreros al aproximarse la época de la parición.
6.7.
Continuación de los estudios sobre propiedades fungistáticas de la fosfina, y
su capacidad de inhibir la biosíntesis de aflatoxinas en granos almacenados.
En 1999 habíamos
realizado un estudio para la Empresa Fugran, que se especializa en el
tratamiento con fosfina de granos almacenados en silos, para combatir plagas de
insectos y roedores. En esa oportunidad demostramos que por encima de cierta
dosis, la fosfina provoca efectos perdurables en el Aspergillus parasiticus,
a punto tal que el hongo que crece después de eliminar el fumigante no
sintetiza micotoxinas, o lo hace en una cantidad mucho menor que el hongo no
tratado. Este trabajo fue publicado en Mycopatologia.
Ahora Fugran a
recurrido nuevamente a nuestro Laboratorio, con la idea de constatar si un
tratamiento reiterado con dosis bajas de fosfina (500 y 150 partes por millón)
puede producir un efecto más efectivo que una sola aplicación con una dosis
mayor.
Hemos comenzado a trabajar en este
proyecto a mediados del mes de abril del 2003. Hasta ahora lo que hemos hecho
es acondicionar los recipientes herméticos que usaremos para la exposición al
gas, hemos medido su volumen y hemos calibrado las cantidades de fosfuro de
magnesio que son necesarias para lograr una concentración de 500 y 150 ppm de
fosfina en cada uno de dichos recipientes.
La descripción detallada del
proyecto, que se extenderá hasta los primeros meses del 2004, se puede ver en
la sección 20.3.
7. TRABAJOS REALIZADOS O PUBLICADOS EN EL PERIODO
7.1. PUBLICACIONES
7.1.1.A simple
thin-layer chromatographic method for the detection of ergovaline in leaf
sheaths of tall fescue (Festuca arundinacea) infected with Neotyphodium
coenophialum. A. Salvat y H.M. Godoy. Journal
of Veterinary Diagnostic Investigation 2001; 13 (5): 446-9.
7.1.2. Screening of some plants from Northern Argentina for their
antimicrobial activity.
Salvat A, Antonacci L, Fortunato RH, Suarez EY, Godoy HM. Letters in Applied Microbiology
2001; 32 (5): 293-7.
7.2 TRABAJOS EN PRENSA
7.2.1. Antimicrobial activity in
methanolic extracts of several plant species from northern Argentina. Salvat A,
Antonacci L, Fortunato RH, Suarez EY, Godoy HM. Phytomedicine 2003; en prensa (Copia de galera agregada en la
documentación de respaldo).
7.4. TRABAJOS TERMINADOS Y AUN NO ENVIADOS
7.4.1.
Los trabajos descritos en esta sección fueron realizados en el
marco del Convenio INTA-UNITAN, que ha culminado exitosamente con la
comercialización del producto TQ como aditivo para alimentación de rumiantes en
la Comunidad Europea. Hasta hace 2 meses, UNITAN había requerido que estos
datos se manejasen bajo normas de confidencialidad. Ahora la Empresa ha
autorizado la redacción de los trabajos en formato científico para su
publicación, con la salvedad de que no se revele la composición química o el
origen del producto, lo que es entendible por no tratarse de un producto
patentable, y teniendo en cuenta las sumas considerables que la empresa ha
invertido en estos estudios.
Los textos completos en español han
sido incorporados en los informes anteriores (1997-2001). En estos momentos
estamos redactando los trabajos en inglés.
7.4.2. Measurement of the effects of the
feed additive (TQ) on the in situ ruminal degradability of dietary
protein using the nylon bag technique. (A. Salvat, L. Antonacci, J.Carrillo,
G.Berra y H.M.Godoy).
Abstract
In order to determine the effects of the feed additive TQ on the
ruminal degradability of dietary protein, mixtures of ground wheat and soybeans with either 2 % or 5% TQ were
prepared and tested for in situ degradability in bovine rumen using 7 x 14 cm
nylon bags, pore size 0.04 mm. The experimental groups were: control wheat,
control soybean, 2% and 5 % TQ + wheat, 2 % and 5 % TQ + soybean. Times of
incubation were 0, 3, 6, 9, 12 and 24 hours.
Two cows carrying ruminal fistulae were used. Duplicate series of
6 bags were prepared for each of the 6 experimental groups. Each series of bags
were placed into the ruminal cavity of each of the 2 fistulated cows, and were
incubated for the predetermined time periods.
At the end of the ruminal incubations, the bags were thouroughly
washed with water, dried, and the amounts of the remaining protein were
determined by the Kjeldahl method.
The results indicated that
up to 12 hours there was a clear inhibition of wheat protein degradability by 2
% and 5 % TQ, whereas soybean protein
digestion was inhibited by 5 % TQ. After 24 hours of incubation no significant
differences were observed, indicating that the effects are transient.
These results indicate that TQ
might be an excellent tool for improving dietary nitrogen utilization in
feeds containing protein of high ruminal degradability.
7.4.3. Effects of the feed additive (TQ)
on the nitrogen and energy metabolism in the bovine rumen. (A.Salvat,
J.Carrillo, C.Arakaki, L.Antonacci, G.Berra, J.Pereira y H.M.Godoy).
Abstract
Fistulated male (cows) of the same breed, age and size, were fed
diets containing 0, 1 %, 2 %, 5 % and 10 % of TQ, calculated on the basis of
total dry matter intake. The relative amounts of feed and forage consumed by
the animals were kept constant, and the consumption of both components were
measured on a daily basis. Total exposure time was 3 weeks.
At the beginning and at the end of each experiment, serial samples
of ruminal content were taken every 2 hours after a 12 h fasting period, and the diurnal variations in the ammonium
nitrogen content, ruminal pH and volatile fatty acids (VFA) were determined,
whereas several representative samples were taken for microbiological analysis.
It was found that there was a significant dose-related inhibition of ruminal
ammonium content, together with a relative acidification, whereas the VFA
levels were not significantly affected. The microbial populations were not
significantly altered.
On the other hand, two animales exposed to 5 and 10 % TQ were
sacrificed and submitted to a visual and microscopic inspection of the internal
organs. Only at 10 % TQ some adverse effects were observed, indicating that the
maximum tolerated dose was 5 %.
These results are consistent with a beneficial effect of TQ on the
nutritional utilization of highly degradable dietary protein.
7.6. INFORMES Y
MEMORIAS TECNICAS.
7.6.1. Se resumen los informes
elaborados con motivo del trabajo realizado por cuenta de la empresa Janssen
Cilag Farmaceutica Argentina. Estos estudios se han completado en marzo del
corriente año, y están en estos momentos siendo analizados por el Departamento
Científico de la empresa matriz, en Bélgica. De acuerdo al convenio firmado con
la Empresa, estos trabajos podrán ser publicados en revistas científicas
internacionales.
7.6.2. Inhibitory effects of Clinafarm Smoke
on several mycotoxigenic fungi. (L. Antonacci, A. Salvat y H.M.Godoy)
Abstract
The present work was undertaken
with the purpose of evaluating the effectiveness of the product Clinafarm Smoke
as a preventive agent against the presence of viable toxigenic fungi in storage
bins for cereal grains, oilseeds, or mixed feeds. Test organisms were: Aspergillus
parasiticus, Aspergillus ochraceus, Fusarium graminearum and Fusarium
moniliforme. The assays were
performed using 2 types of fungal preparations: a fresh agar culture containing
vegetative mycelium, and fully grown agar cultures covered with abundant fungal
conidia. About 72 replicates of both preparations were used as probes to test
the distribution of the active smoke over the inner space of a 50 cubic meter
room. It was found that after only 1 hour of exposure to the active smoke,
there was 100 % inhibition of the mycelial growth, with the exception of
Aspergillus ochraceus, where inhibition was 30 % after 1 hour and about 80 %
after 3 hours of exposure.
On the other hand, the viability of
the conidia exposed in the dry state was almost unaffected by the active smoke,
irrespective of the time of exposure. However, it was speculated that the
results might not be relevant with respect to the "real" situation, since the traditional methodology
for determining conidial viability requires shaking with a water/Tween
solution, i.e., there may be a "washing" of the fungal particles.
7.6.3. In situ inactivation of
toxigenic fungal conidia after treatment with Clinafarm Smoke.
(H.M.Godoy, A.Salvat y L.Antonacci).
Abstract
It is reported that, when the germinating capacity of fungal
conidia treated with the antifungal product Clinafarm Smoke is measured in
situ using a colorimetric redox methodology, there is a highly significant inhibition ( > 99 % ) of the
treated fungal particles, as compared to untreated controls. However, these
treated fungal conidia appear to be unaffected when their viability is measured
with the routine methodology, involving suspension in water/Tween and culture
on a fresh agar medium.
These results indicate that, although dry fungal conidia are not killed by the antifungal agent, they may be unable to
germinate and multiply, even under favorable climate conditions, as long as
they are not "washed" with
water or otherwise disturbed with any mechanical procedure.
It is concluded that the antifungal product may be effective for
its purported use as a "preventive adjuvant" after the cleaning of
storage bins for animal feeds.
11. DIRECCION DE BECARIOS Y/O
INVESTIGADORES.
11.1. Ing. Agr. Adriana Salvat. Investigador asistente de INTA. Integrante
del Laboratorio de Toxicología,
Instituto de Patobiología, CICVyA. Tema: Micotoxinas en cereales y en
gramineas forrajeras.
11.2. Ing. Agr. Liliana Antonacci.
Becaria financiada por la Fundación ArgenInta, en el Laboratorio de
Toxicología, Instituto de Patobiología, INTA, CICVyA. Tema: taxonomía de
plantas, evaluación de efectos biológicos de extractos vegetales, nutrición de
rumiantes.
11.3. Med. Vet. Marcela Roigé.
Pasante perteneciente a la Cabaña Avícola Jorju. Entrenamiento en el análisis
de micotoxinas en el Laboratorio de Toxicología.
13. PARTICIPACION EN REUNIONES CIENTIFICAS
13.1. Congreso Argentino de Microbiología.
Trabajo presentado: Búsqueda de
actividad antimicrobiana en extractos de plantas autóctonas del Norte
Argentino. A. Salvat, L. Antonacci, R. Fortunato, E.Suáres y H.M. Godoy.
Setiembre de 2001.
13.2. Jornadas Argentinas de
Toxicología. Invitado como Coordinador de Sesión de Posters sobre Toxicología
Alimentaria. Rosario. Setiembre de
2001.
15.
SUBSIDIOS RECIBIDOS EN EL PERIODO.
15.1.
PIP CONICET Nº 4197.
2001 - 2002 ........... $
11000.-
2002 - 2003 .......... $
11000.-
15.2.
FONDOS DERIVADOS DE CONVENIOS CON EMPRESAS.
2002 Janssen Cilag Farmacéutica ........... $ 10000.-
2003 Empresa Fugran
............................
$ 19000.-
17.
ACTUACION EN ORGANISMOS DE PLANEAMIENTO, PROMOCION O EJECUCION CIENTIFICA Y
TECNOLOGICA.
17.1. Administración Nacional de Alimentos, Medicamentos y
Tecnología Médica. Instituto Nacional de Alimentos. Integrante de la Comisión Asesora en Toxicología, designada por
Resolución del Administrador de ANMAT.
Participación en 3 reuniones y redacción de un informe técnico sobre una
pintura insecticida propuesta para uso domiciliario.
17.2. Servicio
Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA). Integrante de Comisión Asesora de Biología y
Toxicología. Participación en reuniones sobre micotoxinas en trigo desde fines
del 2002. Participación en la organización de un Seminario sobre: Problemas
Asociados con la Fusariosis del Trigo y
Estrategias para su Prevención
(Entidades organizadoras: SENASA, INAL, INTI e INTA). Designado como
disertante sobre: Aspectos toxicológicos de las micotoxinas de Fusarium y
evaluación de riesgo. El Seminario tendrá lugar en la Bolsa de Cereales en
Julio de 2003.
17.3. Asesor por parte del INTA en
una auditoría sobre riesgo profesional relacionado con el trabajo con
micotoxinas, a raíz de una denuncia ocurrida en el Pabellón de Industrias de la
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires.
Disertante en un Taller sobre este tema, convocado por el Decanato de dicha
Facultad. 29 de mayo de 2003.
18. TAREAS
DOCENTES DESARROLLADAS EN EL PERIODO
18.1. Profesor Invitado. Curso de Complementos en Toxicología. Dictado
de 3 clases sobre Micotoxinas, Contaminantes orgánicos e inorgánicos y
Alimentos derivados de Biotecnología. 3
clases de 4 horas. Setiembre de 2001. Setiembre de 2002.
18.2. Profesor Invitado. Carrera de Higiene y Seguridad. Clase sobre
"Sustancias de alta toxicidad en alimentos". Octubre de 2001. Octubre de 2002.
18.3. Profesor Invitado. Carrera de Post Grado en Medicina
Laboral. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad de Buenos Aires. Clase sobre
Toxicología Alimentaria. Julio de de 2002.
18.4. Disertante Invitado. Jornada de
Nutrición Celular. Organizado por el Departamento de Graduados de la Facultad
de Medicina de la Universidad de Buenos Aires y el Servicio de Endocrinología
del Hospital Posadas, 28 de Octubre de 2001 en el Hospital Alejandro Posadas.
Prov. de Buenos Aires. Clase
sobre: Aspectos toxicológicos de edulcorantes sintéticos.
19. OTROS
ELEMENTOS DE JUICIO NO CONTEMPLADOS EN LOS TITULOS ANTERIORES.
19.1.
Integrante del Panel de Especialistas en Ciencias Biológicas,
designado por el Secretariado del Comité Mixto de Expertos FAO/OMS en Aditivos
y Contaminantes de Alimentos.
19.2. Actuación como Jurado.
19.2.1. Integrante
del Jurado para designación de Docentes Auxiliares del Departamento de Química
Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos
Aires. Mayo de 2002.
19.2.2. Integrante
del Jurado de evaluación de la tesis: "Efectos de la intoxicación aguda
por micotoxina T-2 en el ratón. Estudios histopatológicos, ultraestructurales,
inmunohistoquímicos y lectinhistoquímicos", elaborada por la Med.Vet.
María Alejandra Quiroga, para optar al título de Doctora en Ciencias
Veterinarias, de la Universidad Nacional de La Plata. Marzo de 2003.
19.2.3. Integrante del Jurado
para designación de Profesor Titular de Toxicología Alimentaria, de la
Universidad de Morón. Mayo de 2003.
20. TITULO Y PLAN DE TRABAJO A REALIZAR EN
EL PROXIMO PERIODO.
20.1. Investigación de componentes con
actividad biológica en plantas autóctonas de la República Argentina. (PIP CONICET 4197).
Una de las líneas de trabajo
programadas consiste en realizar el fraccionamiento y la identificación de los
componentes activos de los extractos que han sido seleccionados por poseer
alguna actividad biológica interesante, entre las ensayadas hasta el momento.
En particular, se trabajará con los 7 extractos que han demostrado tener
actividad inhibitoria contra el Mycobacterium tuberculosis, y en
particular, como primera prioridad, los extractos de Cercidium praecox,
Bulnesia sarmientoi y Pterogyne nitens, porque los 2 primeros inhiben el Mycobacterium con una CMI
de apenas 62 µg/ml, y el tercero con una CMI de 125 µg/ml. Estos rangos de inhibición
parecen excepcionalmente altos, tratándose de extractos crudos. El otro
extracto que resultó fuertemente inhibitorio para Mycobacterium es el de
Vassobia breviflora, pero en este caso ya tenemos una buena cantidad de
producto activo cristalino, y estamos a punto de enviarlo a un Laboratorio de
Servicios para su identificación química.
Como es obvio,
toda una gama de potenciales estudios posteriores dependerá de la naturaleza
química de los componentes activos que se aíslen. Si se trata de sustancias
nuevas, habrá mucho trabajo para caracterizar completamente sus propiedades,
incluyendo sus posibles efectos tóxicos. Si se trata de sustancias ya
conocidas, habrá que investigar si sus propiedades biológicas ya han sido
estudiadas.
Otras líneas de
trabajo que ya están comenzando en este momento implican ensayar los extractos
de las 120 especies que tenemos identificadas con 2 nuevos bioensayos: 1) medir
actividad antiviral, trabajando con líneas celulares que son utilizadas en
forma rutinaria en la Unidad de Cultivo de Tejidos de INTA, y con un método
colorimétrico redox para medir la viabilidad celular. Estos métodos ya han sido
puestos a punto en nuestro Instituto.
El otro bioensayo
a utilizar se refiere a la detección de actividad repelente de insectos. El
ensayo requiere la utilización de moscas, y ya existe en el INTA un grupo de
trabajo especializado en estos temas. La capacidad de repeler estos insectos o
de impedir la eclosión de las larvas forma parte del arsenal defensivo de
algunas plantas contra insectos depredadores. La identificación de sustancias
que tengan esta capacidad en alguna de las plantas que estamos estudiando sería
potencialmente de gran valor, tanto ecológico como económico.
20.2. Estudios sobre toxicidad de Condalia megacarpa. (Mal del
piquillín).
Para continuar este estudio,
intentaremos en primer término ver si es posible reproducir la toxicidad en
ratones de laboratorio. Si lo lográsemos, esto podría permitirnos avanzar mucho
más rápido, en parte por el menor costo de estos animales, y además por su
facilidad de manejo, y consecuentemente la posibilidad de realizar
simultáneamente numerosos ensayos.
El trabajo a realizar en esta etapa,
ya sea con ratones, cobayos o cualquier otro sistema de bioensayo que sea
factible, es un poco tedioso, pero inevitable: deberemos comenzar a realizar un
fraccionamiento cromatográfico del extracto en diclorometano de la corteza de
piquillín, y ensayar una por una todas las fracciones para ubicar dónde se
encuentra la toxicidad. Luego habría que comenzar a ensayar toda clase de
reactivos químicos hasta encontrar una forma de identificar la fracción activa
sin necesidad de recurrir permanentemente al ensayo de toxicidad en animales.
20.3. Comparación de los efectos de un tratamiento simple o reiterado
con fosfuro de hidrógeno (fosfina) sobre el crecimiento de Aspergillus
parasiticus y la biosíntesis de aflatoxinas en maíz y maní. (Proyecto
INTA-FUGRAN S.A.)
A fines de mayo de 2003 este proyecto lleva 45 días de
ejecución. El plazo previsto para su finalización se extiende hasta
febrero-marzo de 2004. Con los resultados del estudio se redactará una
publicación científica, como se hizo en la ocasión anterior.
20.3.1. Tratamiento de granos
con fosfina. Diseño experimental.
En el trabajo realizado previamente en
este Laboratorio, se utilizaron desecadores de material acrílico para vacío,
que por una parte tienen un burlete de goma que permite lograr un cierre
hermético, y por otra parte tienen un tubo de salida para aplicar el vacío,
cerrado con un robinete de teflon, a través del cual se puede tomar una muestra
de la atmósfera en el interior del recipiente, sin modificar su contenido. Uno
de los problemas que se detectaron en esa ocasión es que en algunos casos el
cierre no era lo suficientemente hermético como para impedir la difusión de la
fosfina, y eso llevó a tener que desechar numerosos datos experimentales.
En base a la experiencia adquirida, se
llegó finalmente a adoptar los siguientes criterios para considerar aceptable
cada experimento: 1) se mide la concentración de fosfina al comienzo (Ci) y al
final (Cf) del período de exposición, 2) si
Cf < ½ Ci, la serie experimental es desechada. 3) si Cf ³ ½ Ci,, se aceptan los datos y
se refieren al promedio de Ci y Cf.
Los desecadores deben ser
“calibrados” previamente en forma individual, para lo cual se mide en primer
término el volumen total de cada uno, y luego se calcula la cantidad de fosfuro
de aluminio o de magnesio que se requiere para generar la concentración deseada
de fosfina en cada caso.
Como
las cantidades de fosfuro que se requieren son muy pequeñas (10 a 50
miligramos), es necesario moler las pastillas de fosfuro (en una atmósfera de
muy baja humedad relativa) y fraccionarlas en pequeñas ampollitas de vidrio,
que se cierran herméticamente a la llama.
Cuando se da comienzo a un experimento de
exposición a fosfina, se colocan dentro del desecador todos los cultivos que
van a ser tratados, se aplica una generosa cantidad de grasa de silicona en las
juntas, se agrega la cantidad que corresponda de ampollitas de vidrio
conteniendo el fosfuro, y cuando está todo dispuesto se rompen las ampollitas
con una varilla metálica, e inmediatamente se tapan los desecadores en forma hermética.
Se deja transcurrir 1 hora, aproximadamente, y se mide la concentración inicial
de fosfina (Ci). Luego, se colocan los desecadores en la cámara de 28 º C, y al
finalizar el período de exposición se toma otra muestra de la fase gaseosa del
recipiente para medir Cf.
Para
medir la concentración de fosfina se utiliza una bomba manual aspirante que
extrae un volumen predeterminado de la fase gaseosa, y el gas se hace pasar a
través de tubitos reactivos precalibrados para medir la fosfina en partes por millón
(ppm).
20.3.2. Medición de los efectos
de la fosfina sobre la velocidad de crecimiento del Aspergillus parasiticus. inoculado sobre maíz y maní
con y sin cáscara.
20.3.2.1. Inoculación de los
granos con esporas de A. parasiticus..
Una suspensión de
esporas de A. parasiticus NRLL 2999 se sembrará en un tubo conteniendo
agar-papa-dextrosa (PDA). Se incubará durante 7 días a 28 °C, y posteriormente
se agregarán 5 ml de agua estéril conteniendo 0.05 % de Tween 20, y se agitará
enérgicamente con Vortex durante 1 minuto. La suspensión resultante será
diluida 1/100 y sobre una alícuota de la misma se realizará un recuento de
esporas utilizando un hemocitómetro de Neubauer.
20.3.2.2. Medición de velocidad
de crecimiento del A. parasiticus sobre los granos
inoculados.
Trabajando con cajas de Petri estériles de
9 cm de diámetro, se colocarán 5 gramos de cada uno de los sustratos a
ensayar (maíz, con maní sin cáscara y con maní con cáscara) previamente lavados
con hipoclorito de sodio 5 %, para inactivar la flora saprófita superficial.
Con los granos así tratados se realizará un ensayo para determinar el límite de
sensibilidad del método de medición de la velocidad de crecimiento del hongo en
las condiciones de trabajo. Los 3 sustratos
se inocularán con alícuotas de la suspensión de esporas, conteniendo 102, 103 ó
104 partículas por gramo.
Las cajas se taparán y se incubarán a 28º C durante 2, 4, 6 y 8 días, y al
finalizar cada período se transferirán los granos contaminados a recipientes conteniendo 20 ml de agua
destilada estéril. Después de agitar fuertemente para resuspender todas las
partículas del hongo, se medirá 1 ml del sobrenadante, y se diluirá con 24 ml
de agua estéril. Una alícuota de 0,1 ml de esta suspensión se dispersará sobre
la superficie de medio de cultivo agarizado (YGC) previamente solidificado en
cajas de Petri de 9 cm de diámetro. Estas cajas se colocarán en cámara de 28º
C, y a las 48-72 horas se contará el número de unidades formadoras de colonias
(ufc). Todas las mediciones se realizarán por duplicado. Con los resultados
obtenidos se determinarán los tamaños de inóculo, los tiempos mínimos de
incubación y las diluciones de trabajo requeridas para cada uno de los
sustratos.
Para medir la cinética de proliferación
del hongo sobre los granos estudiados, se trabajará con 5 gramos de cada
sustrato, que se inocularán a tiempo cero con una cantidad mínima de esporas,
en base a los resultados del ensayo anterior.
Para cada grano, se inocularán 70 cajas,
que serán divididas en 5 grupos con 14 cajas cada uno. Los grupos I, IV y V se
colocarán en cámara de 28º C en la forma habitual. Los grupos II y III se
colocarán en desecadores herméticos donde se generará una atmósfera con 500 ppm
de fosfina, en la forma indicada en 2.3. Al cabo de 5 días, la fosfina será
disipada y las cajas de los grupos II y III se colocarán en atmósfera normal
junto con las de los grupos I, IV y V. Ese mismo día se inoculará un nuevo
grupo de 14 cajas (grupo VI), con una nueva suspensión de esporas. Este grupo
se incubará en atmósfera normal.
El día 9 las cajas del grupo III se
introducirán nuevamente en desecadores, donde se generará una atmósfera de 150
ppm de fosfina. Asimismo, con las cajas de los grupos IV y V se procederá de
manera similar, pero se someterán a 500 ppm de fosfina. El día 14 la fosfina
será ventilada, y finalmente el día 17 las cajas del grupo V se someterán a 150
ppm de fosfina hasta el día 21. También el día 17 se inoculará un último grupo
(VII), que se incubará en aire.
Los días 3, 6, 9, 13-14, 17, 20, 22, 23,
27 y 30 se retirarán 2 cajas de cada grupo, según lo indicado esquemáticamente
en la Fig. 1, para realizar el recuento de ufc totales, para lo cual el
contenido de cada caja de Petri será transferido a un recipiente con 50 ml de
agua estéril, la suspensión resultante será diluida 1/10, 1/100 y/o 1/1000, y
se tomarán alícuotas de 0.1 ml de cada dilución para realizar un recuento de
ufc en cajas de Petri conteniendo agar YGC.
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DIAS |
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20 |
21 |
22 |
23 |
24 |
25 |
26 |
27 |
28 |
29 |
30 |
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Toma de muestras.
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PH3
500 ppm.
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PH3
150 ppm.
Figura 1. Esquema de tiempos de inoculación,
exposición a fosfina y toma de muestras.
20.3.3.
Medición del efecto de la fosfina sobre la biosíntesis de aflatoxinas,
en maíz
y
maní contaminados con Aspergillus
parasiticus.
En matraces de 250
c.c., se colocarán 20 gramos de cada uno de los granos a ensayar, se agregarán
6 ml de agua destilada y se esterilizarán en autoclave a 121º C durante 20
minutos. Posteriormente todos los granos se inocularán con 104
esporas de Aspergillus parasiticus, preparadas como se indica en 20.3.2.
En ensayos previos se demostró que con este acondicionamiento se logran condiciones
propicias para que el hongo produzca cantidades considerables de aflatoxinas.
Los matraces se incubarán durante 3 días a 28°C, para que los cultivos alcancen
la fase estacionaria y comiencen a producir las micotoxinas.
A raíz de la
variabilidad característica de la formación de aflatoxinas, se deberán realizar
como mínimo triplicados de todos los puntos experimentales. Además, como la
capacidad de los desecadores no es suficiente como para tratar con fosfina
simultáneamente a todos los preparados, se deberá trabajar por tandas de unos
40 matraces, la mitad de los cuales será tratada con fosfina y la otra mitad se
utilizará como control. Es decir, la comparación entre tratados y controles se
deberá realizar siempre entre matraces del mismo lote.
Una vez
finalizados los períodos de exposición,
se dejará disipar el gas, y los matraces se mantendrán a 28 º C hasta completar 48 y 72 hs, 7, 14, 30, 60, 90 y 180 días.
Al
completar los períodos predeterminados, se agregarán a cada recipiente 50 ml de
metanol/agua (60:40), y luego se determinarán las aflatoxinas por cromatografía
en capa delgada en la forma habitual.