INFORME
Informe período: 1 de junio de 2001 - 31 de mayo de 2003
1. Apellido: Guiamet
Nombres: Juan
José
2. Tema de Investigación:
Degradación de proteínas foliares en cultivares de trigo susceptibles y
tolerantes al estrés hídrico post-antesis.
3. Datos relativos a ingreso y
promociones en la carrera:
Ingreso:
Categoría Asistente Mes:
setiembre Año: 1987
Actual:
Categoría Independiente
Mes: mayo Año:
1998
4. Institución donde desarrolla los
trabajos:
Instituto de Fisiología Vegetal
Facultades de Ciencias Agrarias y Forestales y de
Ciencias Naturales y Museo,
Universidad
Nacional de La Plata.
Calle 61 y 117,
La Plata, Pcia. de Buenos Aires.
Tel.: (0221) 4236618
Cargo que ocupo: Investigador Independiente - Prof.
Adjunto (dedicación simple).
5. Director de Trabajos:
No corresponde.
6.
Exposición sintética de la labor desarrollada en el período:
En líneas generales, he continuado con el estudio del mecanismo y la regulación de la degradación del aparato fotosintético de plantas de cultivo durante la senescencia normal de las hojas y en situaciones de estrés por deficiencia hídrica. Las dos preguntas más importantes que he intentado responder en este período son: 1) ¿cuáles proteasas tienen un rol importante en la degradación de proteínas foliares? y 2) ¿dónde ocurre la degradación de proteínas?. El enfoque aplicado combina técnicas de fisiología y bioquímica vegetal con métodos modernos de biología celular. Además del trigo, en este período se ha incorporado el uso de Arabidopsis thaliana como especie modelo, para aprovechar los variados recursos genéticos disponibles en esta especie. En aquéllos casos en que hemos podido realizar los mismos experimentos en trigo y Arabidopsis hemos obtenidos resultados muy similares, reforzando la idea de que los hallazgos obtenidos en Arabidopsis podrán ser extrapolados/adaptados a plantas de cultivo. Entre los logros más importantes en este período puedo destacar:
1- Determinamos que la mayor contribución fotosintética de la espiga (comparado con las hojas) en plantas de trigo sometidas a estrés hídrico está asociada con una menor velocidad de degradación del aparato fotosintético de la espiga y una mayor eficiencia fotoquímica en tales condiciones (Martinez et al., 2003, Physiologia Plantarum en prensa).
2- Identificamos dos proteasas aspárticas y cuatro proteasas cisteínicas cuya actividad aumenta sustancialmente durante la senescencia normal del trigo, y en distintas situaciones de estrés (sequía, deficiencia de nitrógeno y oscuridad contínua). Hemos identificado proteasas similares en Arabidopsis, que serán objeto en el futuro de un análisis proteómico.
3- Caracterizamos exhaustivamente un nuevo tipo de vacuolas líticas asociadas a la senescencia foliar, caracterizadas por contener la más alta actividad proteolítica de la célula y, por lo tanto, candidatas a constituir el sitio donde ocurre la degradación de proteínas en hojas senescentes.
4- Determinamos el impacto del estrés oxidativo en distintas organelas de plantas de trigo sometidas a estrés hídrico.
5- Identificamos en forma preliminar un QTL (“quantitative trait
locus”) involucrado en el control de la longevidad foliar en Arabidopsis.
Dado que la senescencia foliar tiene un impacto
significativo sobre el rendimiento de los cultivos y la vida poscosecha de las
hortalizas verdes, los estudios sobre el mecanismo y regulación de este proceso
son la base para su manipulación con vistas a mejorar el rendimiento potencial
de los cultivos o prolongar la vida poscosecha de hortalizas.
7. Trabajos
de investigación y desarrollo realizados o publicados en este período.
7.1.
Publicaciones
7.1.1.- Luquez, V.M. y Guiamet, J.J. The stay green
mutations d1 and d2 increase water stress susceptibility in
soybeans. J. Exp. Bot. 53: 1421-1428, 2002.
ABSTRACT
The stay green mutant
genotype d1d1d2d2 inhibits the breakdown of chloroplast components in
senescing leaves of soybean (Glycine max L. Merr.). Together with G (a
gene that preserves chlorophyll in the seed coat) they may extend
photosynthetic activity in some conditions. While wild type soybeans maintain
high leaf water potentials right up to abscission, leaves of (GG)d1d1d2d2 dehydrate
late in senescence, which suggests that water relations may be altered in the
mutant.
Three-weeks old plants were subjected to a moderate water deficit (soil water potential = -0.7 MPa) for 7-10 days. Leaf water potential and relative water content decreased significantly more in response to water deficit in unifoliate leaves of GGd1d1d2d2 than in a near-isogenic wild type line. Down-regulation of stomatal conductance in response to drought was similar in mutant and wild type leaves. Likewise, exogenously applied ABA reduced stomatal conductance to a similar extent in the mutant and wild type, and applied ABA failed to restore water deficit tolerance in GGd1d1d2d2. Experiments with explants lacking roots indicate that the accelerated dehydration of GGd1d1d2d2 is probably not due to alterations in the roots. In a comparison of near-isogenic lines carrying different combinations of d1, d2 and G, only d1d1d2d2 and GGd1d1d2d2 (i.e. the genotypes that cause the stay green phenotype) were more susceptible to water deficit than the wild type. These data suggest that pathways involved in chloroplast disassembly and in the regulation of stress responses may be intertwined and controlled by the same factors.
Participé en el
planeamiento de los experimentos, y en la redacción del trabajo.
7.1.2.- Guiamét
J.J., Tyystjärvi E., Tyystjärvi T., John I., Kairavuo M.,
Pichersky P. y Noodén L.D. Photoinhibition and loss of photosystem II
reaction center proteins during senescence of soybean leaves. Enhancement of photoinhibition by the
“stay-green” mutation cytG. Physiol. Plant. 115: 468-478, 2002
The
“stay-green” mutation cytG in soybean (Glycine max) partially
inhibits the degradation of the light-harvesting complex II (LHCII) and the
associated chlorophyll during monocarpic senescence. cytG did not alter the breakdown of the cytochrome b6/f
complex, thylakoid ATP synthase or components of Photosystem I. In contrast, cytG accelerated the
loss of oxygen evolution activity and PSII reaction-center proteins. These data
suggest that LHCII and other thylakoid components are degraded by separate
pathways. In leaves induced to senesce
by darkness, cytG inhibited the breakdown of LHCII and chlorophyll, but
it did not enhance the loss of PSII-core components, indicating that the
accelerated degradation of PSII reaction center proteins in cytG was
light-dependent. Illumination of mature and senescent leaves of wild-type
soybean in the presence of an inhibitor (lincomycin) of chloroplast protein
synthesis revealed that senescence per se did not affect the rate of
photoinhibition in leaves. Likewise, mature leaves of the cytG mutant
did not show more photoinhibition than wild-type leaves. However, in senescent cytG leaves,
photoinhibition proceeded more rapidly than in the wild type. We conclude that the cytG mutation
enhances photoinhibition in senescing leaves, and the rapid loss of PSII
reaction-center proteins during senescence in cytG is caused by
photoinhibition.
Participé en el
planeamiento y la ejecución del 90% de los experimentos, y en la redacción del
trabajo.
7.2.
Publicaciones en prensa
7.2.1.- Guiamét,
J.J., Luquez, V.M. Leaf senescence and related processes. En Control of
diseases and disorders in horticultural crops, R. Dris (ed.), Haworth
Publishers (en prensa).
Conclusions
Leaf
senescence is a breakdown process that starts with the disassembly of cell
organelles, most noticeably the chloroplasts, and eventually leads to death of
the whole organ. Senescence of leaves may occur at different times during the
life cycle of plants, but it is dramatically accelerated in leaves or shoots
detached from the plant. Over the past two decades, much progress has been made
in elucidating the pathway of chlorophyll degradation. However, and in spite of
the massive and in some cases rapid breakdown of macromolecules in senescing
leaves, we still lack a clear picture of how proteins and nucleic acids are
degraded.
Senescence
is regulated by correlative (i.e., interorgan) influences, hormones and
environmental factors. In harvested vegetables, detaching leaves or severing
the shoot from the roots curtails the supply of root-produced cytokinins (the
main anti-senescence hormone), and stimulates the production of ethylene (a
senescence promoting hormone). Storage in darkness may in itself accelerate the
rate of senescence. Senescence-associated genes probably play a causal role in
cellular breakdown, and they might constitute targets in efforts to retard
postharvest deterioration genetically.
Postharvest
senescence can be slowed down by reducing storage temperature, subjecting
vegetables to heat shock treatments, or lowering O2 and increasing
CO2 concentrations in the
atmosphere. While these treatments are quite effective in extending postharvest
life, they may not be amenable for use at the retail level. Here, genetic
alterations reducing the rate of postharvest senescence may be more useful. The
identification of “stay green” genotypes might help in breeding vegetables with
better shelf life. Ultimately, transgenic technology might be used to create
vegetables with increased production of anti-senescence hormones or reduced biosynthesis
of senescence-stimulating substances. A thorough knowledge of the mechanism and
regulation of senescence may help to design targeted approaches to control
postharvest deterioration of leafy vegetables.
Dado que
este capítulo carece de un abstract, adjunto las conclusiones finales que
resumen las principales ideas desarrolladas. Participé en la búsqueda
bibliográfica, en el procesamiento de la información y en la redacción del
artículo.
7.2.2.-
Noodén, L.D., Guiamet, J.J., John I. Whole plant senescence. En
Senescence and programmed cell death in plants, L.D. Noodén (ed.), Academic
Press, San Diego, CA (en prensa).
I. Introduction
A.
Objectives
B. Patterns
C. What is Whole Plant Senescence?
D. Senescence Parameters
E. Importance of Chronological Age
F. Correlative Controls
G. The Causes of Whole Plant Senescence
H. Evolution and Differences among Monocarpic
Species
II. Complexity
and the Rules of Evidence
III. What is the
Cause of Monocarpic Senescence?
A. Loss of Vegetative Capacity
B. Nutrient and Hormone Deficiencies
C. Death Hormone (Senescence Signal)
IV. Senescence
in Polycarpic Plants and Clones
V. Reproductive Yield
References
Como en el caso de capítulo “Leaf senescence and related processes”, este capítulo no posee un abstract, por lo que, a los efectos de dar una idea de sus contenidos, adjunto el índice temático. Participé en el diseño inicial del capítulo, y la discusión y redacción del mismo.
7.2.3.-
Martínez, D.E., Luquez, V.M., Bartoli, C.G. y Guiamet, J.J. Persistence
of photosynthetic components and photochemical efficiency in ears of
water-stressed wheat (Triticum aestivum L.). Physiol. Plant. (en prensa).
Ear photosynthesis may be an important source of C for grain growth in
water-stressed plants of cereals. The main objectives of this work were to
determine the stability of the photosynthetic apparatus and the photochemical
efficiency of ears in plants subjected to post-anthesis drought. Plants of
wheat (Triticum aestivum L. cv. Granero INTA) were grown in pots under a
rain shelter and subjected to water stress (soil water potential around – 0.6
to – 0.8 MPa) starting 4 days after anthesis. Post-anthesis drought
substantially accelerated the loss of chlorophyll, Rubisco and the
light-harvesting complex of photosystem II (LHCII) in the flag leaf, but the
degradation of these photosynthetic components was much less affected by water
deficit in awns and ear bracts. Quantum yield of PSII (FPSII)
decreased in leaves of water-stressed plants. In contrast, ear bracts had a
higher FPSII than
leaves, and FPSII of ear
bracts did not decrease at all in response to drought. Removing the grains
immediately (less than 30 minutes) before fluorescence measurements slightly
reduced FPSII, indicating
that CO2 supplied by grain respiration may contribute to the high
photochemical efficiency of ears in droughted plants. However, other factors
may be involved in maintaining high FPSII,
since even in the absence of grains FPSII
remained much higher in ear bracts than in the flag leaf. The relative
stability of ear photosynthetic components and their relatively high
photochemical efficiency may help to maintain ear photosynthesis during the
grain filling period in droughted plants.
Participé en el
planeamiento inicial del trabajo, en la ejecución de varios de los
experimentos, y en la redacción del trabajo.
7.2.4.-
Danna, C.H., Bartoli, C.G., Sacco, F., Ingala, L.R., Santa-María, G.E., Guiamet,
J.J. y Ugalde, R.A. Thylakoid-bound ascorbate peroxidase mutant exhibits
impaired electron transport and photosynthetic activity. Plant Physiol. (en
prensa).
Abstract
In chloroplasts, stroma (sAPX) and thylakoid-bound (tAPX) ascorbate peroxidases play a major role in the removal of H2O2 produced during photosynthesis. Since no tAPX mutant plants have been identified so far, the physiological role of this enzyme remains unclear. Here we report that hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) expresses three homeologous tAPX genes (TaAPX-6A, TaAPX-6B, and TaAPX-6D) mapping on group 6 chromosomes. A wheat mutant line lacking TaAPX-6B is deficient in tAPX activity. When grown at high light intensity PSII electron transport, photosynthetic activity and biomass accumulation, were significantly reduced in the mutant plants, indicating that a normal tAPX activity is essential for the normal photosynthetic function. Desite the reduced tAPX activity, mutant plants did not exhibit oxidative damage, probably because of the reduced photochemical activity. This may be the result of a homeostatic mechanism aiming at the reduction of oxidative damage having as a consequence a decrease in growth of the tAPX-mutant plants.
Participé en los experimentos para determinar el impacto de esta mutación en el funcionamiento del aparato fotoquímico, y en la redacción de los resultados y discusión conrrespondientes a los datos de fotosíntesis, eficiencia cuántica y “quenching” fotoquímico.
7.3. Publicaciones
enviadas y aún no aceptadas para su publicación
7.3.1. Martinez, D.E. y Guiamet,
J.J. Distortion of the SPAD 502 Chlorophyll Meter readings by changes in
irradiance and leaf water status. Enviado a Agronomie (adjunto nota
donde se me informa que uno de los revisores recomienda la aceptación de
trabajo, el editor está a la espera de la segunda evaluación).
7.4. Publicaciones
terminadas y aún no enviadas para su publicación
No consigna.
7.5. Comunicaciones
7.5.1. Bartoli, C.G. y Guiamet, J.J. (2001) Ascorbate metabolism in two wheat cultivars with different sensitivity to water stress. p. 55 Fifth Conference on “Oxygen, free radicals and oxidative stress in plants”, Niza, Francia, 19-21/11/01.
7.5.2. Bartoli, C.G., Gomez, F., Martinez, D. y Guiamet,
J.J. (2001) Oxidative damage to proteins and lipids in subcellular fractions of
wheat leaves: effects of water stress. p.138 Fifth Conference on “Oxygen, free
radicals and oxidative stress in plants”, Niza, Francia, 19-21/11/01.
7.5.3. Martínez, D., Luquez, V.M., Bartoli, C., Guiamet,
J.J. (2002) Persistencia de los componentes del aparato fotosintético y elevada
eficiencia fotoquímica en espigas de trigo (Triticum aestivum L.)
sometidas a estrés hídrico. pp. 152-152, Actas de la XXIV Reunión Argentina y
XI Reunión Latinoamericana de Fisiología Vegetal, Punta del Este, 22 – 25 de
octubre 2002.
7.5.4. Otegui, M. Noh, Y-S,
Martinez, D., Guiamet, J.J. y Amasino, R.M. (2002) Detección de una
población de vacuolas líticas asociadas con la senescencia foliar. pp. 222-223
Actas de la XXIV Reunión Argentina y XI Reunión Latinoamericana de Fisiología
Vegetal, Punta del Este, 22 – 25 de octubre 2002.
7.6. Informes y
memorias técnicas
No consigna
8. Trabajos de
desarrollo de tecnologías
8.1. Desarrollos
tecnológicos
No consigna
8.2.
Patentes o equivalentes
No consigna
8.3.
Otras actividades tecnológicas cuyos resultados no sean
publicables
No consigna
8.4.
Sugiera nombres (e informe las direcciones) de las personas ........
No consigna
9.
Servicios tecnológicos
9.1. Determinación
de los niveles de la enzima Rubisco y de clorofila en hojas de papa
provenientes de cultivos sometidos a distintos regímenes de fertilización.
Servicio realizado a la empresa McCain Argentina S.A., por cuenta de la
Fundación de la Facultad de Ingeniería (UNLP), enero a mayo de 2002. Tiempo
dedicado a este servicio: 20 hs (total). Monto facturado por la Fundación de
Ingeniería: $ 2.700 00.
10.1
Docencia
10.1.1 Dictado (como Profesor) del
curso de Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, UNLP.
Curso de grado de régimen anual.
10.1.2. Dictado del curso de
Posgrado “Fisiología de la planta bajo estrés hídrico”, Facultad de Ciencias
Agrarias y Forestales, UNLP, 17 – 21 de setiembre de 2001.
10.2
Divulgación
No consigna
11. Dirección de
becarios y/o investigadores
11.1. Lic. Dana Martinez. Becaria
Doctoral del FONCYT (1999-2003), Instituto de Fisiología Vegetal (UNLP). Tema:
Degradación de proteínas foliares en cultivares de trigo susceptibles y tolerantes
al estrés hídrico post-antesis.
11.2. Dra. Virginia Luquez. Becaria
Post-doctoral del CONICET (2000-2003), Instituto de Fisiología Vegetal (UNLP).
11.3. Dr. Carlos Bartoli.
Investigador Asistente, CONICET (desde 2001), Instituto de Fisiología Vegetal
(UNLP). Tema: Metabolismo carbonado y síntesis de antioxidantes en plantas de
trigo (Triticum aestivum L.) bajo estrés hídrico.
12. Dirección de
tesis
12.1. Tesis de Maestría, Ing. Agr. Adrián Mitidieri. Tema:
Fitotoxicidad de graminicidas postemergentes sobre el cultivo de girasol (Helianthus
annuus). Descripción del daño y factores que inciden en su manifestación.
Universidad Nacional de La Plata, diciembre de 2001.
12.2. Tesis doctoral, Lic. Dana E. Martínez. Tema:
Degradación de proteínas foliares en cultivares de trigo susceptibles y
tolerantes al estrés hídrico post-antesis. Facultad de Ciencias Naturales y
Museo, en ejecución.
13. Participación en
reuniones científicas
13.1. XXIV Reunión Argentina y XI Reunión Latinoamericana de
Fisiología Vegetal. Carácter de participación: expositor. Punta del Este, 22 –
25 de octubre 2002.
14. Cursos de
perfeccionamiento, viajes de estudio
No
consigna.
15. Subsidios
recibidos en el período
Subsidio para
colaboración Academia de Finlandia – SECTIP (Argentina).
Título del proyecto: “Análisis proteómico de proteasas
asociadas a la senescencia foliar en Arabidopsis thaliana”. Proyecto FI
PA02 B01. Los montos asignados se deciden año a año en función de las
necesidades (viajes y visitas) del proyecto.
16. Distinciones o
premios obtenidos en el período
No consigna
17. Actuación
en organismos de planeamiento, promoción o ejecución científica y técnica
18. Tareas docentes
desarrolladas en el período
18.1 Dictado
del curso de Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La
Plata. Dedicación simple (9 hs semanales, equivalentes al 20% de mi dedicación
laboral total).
17.
Otros elementos de juicio no contemplados en los títulos
anteriores
17.1Evaluador del concurso
de Becas para Estudios de Postgrado en Agronomía Alberto Soriano (Fundación
Antorchas – Fac. de Agronomía UBA) 2003.
17.2 Revisión de un trabajo para Plant
Physiology (2002).
17.3.
Jurado de la tesis doctoral Jurado de la Tesis Doctoral de la Lic. María
José Burgin, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA (8/7/02).
17.4.
Jurado de la Tesis Doctoral de la Ing. Agr. Betina Kruk, Facultad de
Agronomía, UBA (12/02).
17.5.
Jurado de la Tesis Doctoral de la Lic. Analía Concellón, Facultad de
Ciencias Exactas, UNLP (04/03).
20. Título y plan de
trabajo a desarrollar en el próximo período.
La senescencia
comprende una serie de procesos degradativos, programados genéticamente, que
culmina en la muerte de células, tejidos u órganos (Noodén y Guiamet, 1996).
Dada la organización modular de la parte aérea de las plantas, la senescencia
representa un mecanismo de reciclado de nutrientes desde las hojas hacia
distintos órganos de reserva, v.g., semillas, tubérculos, etc. La senescencia
prematura causada por enfermedades o factores de estrés puede reducir el
rendimiento de muchos cultivos interrumpiendo el llenado de los granos, y puede
también afectar el almacenamiento postcosecha de las hortalizas de hoja. El
retraso de la senescencia, y la consiguiente prolongación de la actividad
fotosintética del canopeo, podría incrementar el rendimiento potencial de
algunos cultivos (Thomas and Howarth, 2000).
El
metabolismo de la hoja cambia marcadamente durante la senescencia. Se degradan
las proteinas, lípidos, ácidos nucleicos y pigmentos, y esto causa la pérdida
de las funciones asimilatorias de las hojas. Los cloroplastos son las primeras
organelas en manisfestar claros signos de deterioro (Inada et al., 1998) y la
principal fuente del nitrógeno redistribuído durante la senescencia foliar. La
degradación de proteínas cloroplásticas causa una marcada caída en la capacidad
fotosintética de las hojas (v.g., Jiang et al., 1993; Guiamét et al., 2002).
La
degradación de proteínas foliares es un buen ejemplo de las limitaciones de los
enfoques tradicionales aplicados para dilucidar los mecanismos involucrados en
el desmantelamiento de los distintos componentes celulares. In vivo el
ritmo de degradación de proteínas y la actividad proteolítica aumentan durante
la senescencia (Mae et al., 1983; Lamattina et al., 1985, Feller and Fisher,
1994). Representantes de los grupos más importantes de proteasas (i.e.,
proteasas aspárticas, serínicas, cisteínicas y metalo-proteasas) aumentan en
actividad, concentración, o expresión a nivel de mRNA (Distefano et al., 1997;
Buchanan-Wollaston and Ainsworth, 1997; Nakabayashi et al., 1999, Delorme et
al., 2000; Ingvardsen and Veierskov, 2001).
Sin
embargo, es difícil determinar cuáles de estas proteasas participan en la
degradación de proteínas en una organela en particular (v.g., los cloroplastos),
o cuáles están involucradas en la degradación de una cantidad significativa de
proteínas foliares. En primer lugar, en casi todos los casos las proteasas
asociadas a la senescencia han sido identificadas porque su expresión aumenta a
nivel de mRNA, pero en general se desconoce si los niveles de la proteína
correspondiente, o su actividad, aumentan en forma semejante. Por ejemplo, los
niveles del mRNA de ERD1, una chaperonina que facilita la actividad de la
proteasa cloroplástica ClpP, aumentan durante la senescencia en Arabidopsis,
pero los niveles de la proteína disminuyen (Weaver et al., 1999). La expresión
génica en hojas senescentes podría estar controlada, en mayor o menor medida,
por la eficiencia de traducción, por modificaciones post-traduccionales, y por
cambios en la estabilidad de las proteínas correspondientes. En segundo lugar,
a pesar de que la mayor cantidad de proteína degradada durante la senescencia
se localiza en los cloroplastos, la mayor parte de la actividad proteolítica está
localizada en la vacuola (Feller and Fisher, 1994), y algunas proteasas
asociadas a la senescencia tienen señales de localización vacuolar (e.g., Drake
et al. 1996). La localización subcelular de la mayoría de las demás proteasas
asociadas a la senescencia es desconocida.
Varias
observaciones sugieren la participación de vacuolas en la degradación de
proteínas durante la senescencia. Algunas proteasas vacuolares (Drake et al.,
1996) y enzimas de procesamiento vacuolar, es decir proteasas involucradas en
la maduración de proteínas vacuolares, aumentan sus niveles durante la
senescencia (Smart et al., 1995; Kinoshita et al., 1999; Page et al., 2001).
Las hojas senescentes contienen una población característica de pequeñas
vacuolas. Observaciones con el microscopio electrónico de transmisión en
especímenes preservados por fijación a alta presión y criosustitución revelan
la presencia de pequeñas vacuolas específicamente en hojas senescentes (Otegui
et al., 2002), cuyo número aumenta durante la senescencia, y en las que se
acumula la proteasa específica de la senescencia SAG12 de Arabidopsis
(Lohman et al., 1994; Otegui et al. 2002). Experimentos con microscopía
confocal y fluorocromos indicadores de pH y actividad proteolítica indican que
estas vacuolas constituyen una nueva clase de vacuolas ácidas, líticas.
Para
sortear las dificultades mencionadas, y examinar la expresión de proteasas
directamente a nivel de la proteína, en este proyecto se utilizarán modernos
métodos proteómicos para identificar, y asignar a sus correspondientes genes,
proteasas cuyas actividades aumentan durante la senescencia en Arabidopsis.
Identificaremos proteasas en los extractos de hojas, en las vacuolas asociadas
a la senescencia, y en cloroplastos.
Objetivos
En principio, identificaremos
proteasas cuyas actividades aumentan durante la senescencia foliar en Arabidopsis.
Las proteasas de los extractos de hojas maduras y senescentes se separarán por
electroforesis en geles, y sus actividades se detectarán in situ en los
mismos geles. Hemos desarrollado un sistema de electroforesis bi-dimensional y
detección de la actividad en gel (“zimograma 2D) con el que separaremos las
proteasas, y las proteínas en las zonas translúcidas que revelan actividad
proteolítica se identificarán por “peptide mass fingerprint” con MALDI-TOF-MS
(Lahm and Langen, 2000). Nuestros resultados preliminares han revelado al menos
15 proteasas ácidas cuyas actividades aumentan en hojas senescentes de Arabidopsis.
2. Análisis proteómico de proteasas en
las vacuolas asociadas con la senescencia
Para identificar proteasas en las
vacuolas asociadas a la senescencia (Otegui et al. 2002), aislaremos vacuolas
por flotación en gradientes de Ficoll (Höfte et al., 1992). Examinaremos las
actividades proteolíticas de las vacuolas aisladas con zimogramas 2D como se
describe precedentemente, e identificaremos las proteasas por el método de
“peptide mass fingerprint” utilizando MALDI-TOF-MS.
Aunque la mayoría
de los estudios sobre expresión de proteasas a nivel de mRNA no han detectado
proteasas asociadas a la senescencia dirigidas al cloroplasto, no podemos
descartar la existencia de proteasas cloroplásticas cuya expresión a nivel de
proteína o actividad aumente durante la senescencia sin un correspondiente
aumento en los niveles estacionarios de sus mRNAs. Brevemente, aislaremos
cloroplastos intactos, puros, por centrifugación diferencial en un gradiente de
Percoll, y detectaremos proteasas ligadas a las membranas fotosintéticas y en
la fracción estromática utilizando geles bidimensionales y ensayo de la
actividad proteolítica en geles. Estas proteasas serán identificadas
posteriormente por “peptide mass fingerprint” a través de MALDI-TOF-MS.
Resultados esperados: el principal producto
de este proyecto será la identificación (es decir, asignación a un gen) de las
proteasas cuya actividad aumenta durante la senescencia foliar. Este es un paso
previo para encarar otros estudios de expresión y analizar sus funciones
utilizando mutantes “knock out” de dominio público (http://www.arabidopsis.org),
con el objetivo final de identificar proteasas cuya manipulación genética
permita modular la degradación de proteínas foliares. Es de destacar que este
proyecto constituye uno de los primeros intentos en el país para aplicar
técnicas proteómicas al estudio sistemático de un proceso del desarrollo en
plantas. Aunque inicialmente se empleará Arabidopsis porque las técnicas
proteómicas se aplican más eficientemente a organismos con un genoma
secuenciado, en el futuro esta aproximación podrá emplearse en especies de
cultivo (v.g. arroz, maíz) en la medida que avance el conocimiento de sus
respectivos genomas.
Buchanan-Wollaston y Ainsworth (1997) Plant Mol.
Biol. 33: 821-834; Delorme et al. (2000) Plant Physiol. 123:
917-927; Distefano et al. (1997) Biochem. J. 327: 399-405; Drake
et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 755-767; Feller y Fischer
(1994) Critical Rev. Plant Sci. 13: 241-273; Guiamet et al.
(2002) Physiol. Plant. 115: 468-478; Höfte et al. (1992) Plant
Physiol. 99: 561-570; Inada et al. (1998) Planta 206:
585-597; Ingvardsen y Veierskov (2001) Physiol. Plant. 112:
451-459; Kinoshita et al. (1999) Plant J. 19: 43-53; Jiang
et al. (1993) Plant Physiol. 101: 105-112; Lahm y Langen
(2000) Electrophoresis 21: 2105-2114; Lamattina et al. (1985) Plant
Physiol. 77: 587-590; Lohman et al. (1994) Physiol.Plant. 92:
322-328; Mae et al. (1983) Plant Cell Physiol. 24: 1079-1086; Nakabayashi
et al. (1999) Plant Cell Physiol. 40: 504-514. Noodén y Guiamet
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