comision de investigaciones
científicas de la provincia de
buenos aires
INFORME CIENTÍFICO-TECNOLÓGICO[1]
PERIODO: 2001-2002
Legajo Nº: 263
1.
APELLIDO: PARMA
NOMBRES: Alberto Ernesto
2.
TEMA
DE INVESTIGACION
Programa de Biotecnología aplicado a salud pública y sanidad
animal
3.
DATOS
RELATIVOS A INGRESO Y PROMOCIONES EN LA CARRERA
INGRESO: Categoría: Adj. sin dir. Mes:
Abril Año: 1986
ACTUAL: Categoría: Principal desde el mes: Junio Año: 1998
4.
INSTITUCION
DONDE DESARROLLA LA TAREA
Nombre: Universidad
Nac. del Centro, Fac. Cs. Veterinarias
Dependencia: Lab. Inmunoquímica y Biotecnología,
Centro Asociado SAMP
Dirección: Calle: Pinto Nº.
399
Ciudad: Tandil Pcia: Bs As Tel: 02293 422357 / 426667
Dirección
electrónica: aparma@vet.unicen.edu.ar
Cargo que ocupa: Prof. titular excl.; Invest.
Principal CIC, Director Laboratorio.
5.
DIRECTOR
DE TRABAJOS. (En el caso que corresponda)
Apellido y Nombres: no corresponde
Dirección. Calle
Ciudad: Pcia:
Tel:
Dirección electrónica:
....................................................... ..................................................
Firma del Director (si corresponde)
Firma del Investigador
Fecha:
Abril, 2003.
6.
EXPOSICION
SINTETICA DE LA LABOR DESARROLLADA EN EL PERIODO.
En la ejecución del proyecto
“Programa de Biotecnología aplicado a Salud Pública y sanidad animal” se
imprimió una orientación hacia la biología molecular, empleando métodos de
clonado molecular, análisis de genes de virulencia por PCR (reacción en cadena
de la polimerasa) y perfiles genéticos de algunas cepas bacterianas de interés
epidemiológico mediante la técnica de RAPD.
En una de las líneas de trabajo,
aspectos moleculares de la leptospirosis equina, de clonó y secuenció un
fragmento de ADN genómico de leptospira que presenta similitud con una región
del ADN equino, explicando de esta manera que la consecuente uveitis recurrente
de los equinos con leptospirosis tenga su origen en la autoinmunidad que se
desencadena. Los datos de secuencia fueron depositados en un banco de datos y
publicados en un journal.
La otra línea de trabajo, “síndrome
urémico hemolítico y E. coli verotoxigénico” fue desarrollada a partir
del estudio de las características feno y genotípicas de las cepas autóctonas
aisladas de alimentos cárneos, lácteos y de bovinos criados en pastoreo y en
corral. Los hallazgos fueron
significativos, dentro del terreno de la epidemiología molecular, despertando
sumo interés en miembros de la Sociedad Argentina de Pediatría por su carácter
innovativo en el área.
Esos resultados recibieron un
reconocimiento de importancia por parte de la Academia Nacional de Veterinaria
al otorgarnos el premio “Vilfrid Baron” 2001 al mejor trabajo a nivel nacional
por los aportes sobre la sanidad animal y calidad alimentaria.
Por otra parte se ha continuado con
la formación de recursos humanos, inscribiéndose dos nuevos doctorandos bajo mi
dirección.
Entre las dificultades encontradas
en este período cabe mencionar la escasez de recursos tras la devaluación de la
moneda y la merma del presupuesto de nuestra institución.
En algunos aspectos técnicos
contamos con la colaboración del Lab. de Referencia en Escherichia de la
Univ. de Stgo. de Compostela, España.
Recientemente hemos solcitado apoyo
internacional para transformar nuestro laboratorio en un centro de referencia
en E. coli, en apoyo a la comunidad. Entre los objetivos figuran
asesoramiento, servicios de apoyo al control microbioloógico de alimentos, cursos
de entrenamiento en detección de E. coli enterohemorrágico.
7.
TRABAJOS
DE INVESTIGACION REALIZADOS O PUBLICADOS EN ESTE PERIODO.
7.1.
PUBLICACIONES.
7.1.1
Lucchesi P.M., Parma A.E. and Arroyo G.H.
Serovar distribution of a DNA sequence involved in the antigenic
relationship between Leptospira and equine cornea.
BMC Microbiology,
2:3-8, 2002.
Este trabajo
describe la distribución de una secuencia nucleotídica de leptospira,
relacionada proteómicamente con córnea equina, entre distintos serovariedades
de esa bacteria. Ello explica por qué sólo cepas patogénicas desarrollan
uveitis en el equino.
Mi rol en ese trabajo fue codirigir el mismo en apoyo de su
primer autor.
7.1.2 Padola N.L., Sanz M.E., Lucchesi P.L., Blanco J.E., Blanco J.,
Blanco M., Etcheverría A.I., Arroyo G.H. and Parma A.E. First
isolation of the enterohaemorrhagic Escherichia coli O145:H- from cattle in feedlot in Argentina. BMC
Microbiology, 2:1-5 (www.biomedcentral.com/1471-2180/2/6),
2002.
Este estudio
constituye el primer aislamiento de la cepa enterohemorrágica E. coli
O145:H- a partir del ganado bovino en Argentina. La importancia epidemiológica
es significativa, visto que había sido descripta en el humano con síndrome
urémico hemolítico. El bovino queda así confirmado como un reservorio de este
microorganismo. Mi participación ha sido en carácter de director de tesis
doctoral de N.L. Padola, primera autora.
7.1.3 Seijo A., Coto H., San Juan
J., Videla J., Deodato B., Cernigoi B., García Messina O., Collia O., Bassadoni
D., Schtirbu R., Olenchuk A., Mazzonelli G.D., Parma A.E. Distrés respiratorio
debido a hemorragia pulmonar por leptospirosis. Medicina (Bs. As.), 62:135-140,
2002.
Este trabajo, en colaboración con
profesionales e investigadores del Hosp. Nac. de Agudos, “Dr Muñiz” describe
características de cepas patogénicas e leptospira aisladas de casos clínicos en
Argentina. Mi participación se limitó a la confirmación de su patogenicidad
mediante métodos de biol. molecular.
7.1.4 Seijo A., Coto H., San Juan
J., Videla J., Deodato B., Cernigoi B., García Messina O., Collia O., Bassadoni
D., Schtirbu R., Olenchuk A., Mazzonelli G. D. and Parma A.E. Lethal
leptospiral pulmonary hemorrhage: an emerging disease in Buenos Aires,
Argentina. Emerging
Infectious Diseases, 8:1-4, 2002.
Este estudio representa una
continuación del descripto anteriormente. Mi rol es semejante.
7.1.5 Gómez D., Miliwebsky E., Fernández Pascua C.,
Baschkier A., Manfredi E., Zotta M., Nario F., Sanz M., Etcheverría A., Padola
N., Parma A., Rivas M. Aislamiento y
caracterización de Escherichia coli productor de toxina Shiga en
hamburguesas supercongeladas y quesos de pasta blanda. Rev. Arg. de
Microbiología, 34: 66-71, 2002.
En cooperación con Inst. Malbrán y
el Inst. Nac. de Epidemiología, este estudio determina perfiles genotípicos de
cepas de E. coli enterohemorrágico aislados de alimentos lácteos y
carneos. Participé como corresponsable del trabajo.
7.2.
TRABAJOS
EN PRENSA Y/O ACEPTADOS PARA SU PUBLICACIÓN.
7.2.1 Padola N.L., Sanz M.E.,
Blanco M.E., Blanco J.E., Blanco J., Etcheverría A.I., Arroyo G.H., Usera M.A.
and Parma A.E..(2003) Serotypes and virulence genes of bovine shigatoxigenic Escherichia
coli (STEC) isolated from a feedlot in Argentina. Vet. Microbiology, en
prensa
El presente trabajo, parte de una
tesis doctoral de N.L. Padola, describe factores de virulencia a través del
análisis genético de cepas de E. coli verotoxigénico aisladas de bovinos
criados a corral (feedlot). Se dscriben perfiles que se diferencian
significativamente de los hallados en bovinos en pastoreo. Participé en
carácter de director de tesis.
7.3. TRABAJOS ENVIADOS Y AUN NO ACEPTADOS
PARA SU PUBLICACION.
7.3.1 Molina P.M. ,
Parma A.E. and Sanz M.E. Survival
in acidic and alcoholic medium of Shiga toxin-producing Escherichia coli
0157:H7 and non-0157:H7 isolated in Argentina.
(enviado a BMC Microbiology, 2003)
Este estudio y el indicado a
continuación, analiza el comportamiento de las cepas autóctonas no-O157:H7
halladas en alimentos y bovinos. Se hallan condiciones de resistencia al estrés
ácido, alcohólico y térmico que resultan interesantes para la industris de los
alimentos. Pariticipé como director de tesis doctoral de P. Molina.
7.3.2
Molina, P., Sanz, M. E., Lucchesi, P. M., Padola, N. L. and Parma A. E. Growth
limits under acidic conditions and survival in acidic foods of non-O157:H7
verotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) serotypes. Enviado
para su publicación a Food Microbiol.,
Dic. 2002.
7.4.
TRABAJOS
TERMINADOS Y AUN NO ENVIADOS PARA SU PUBLICACION.
7.5.
COMUNICACIONES.
7.5.1 Parma A.E.
Conference:
Toxigenic Escherichia coli isolated from pigs in Argentina. Forum on
food safety and zoonosis. First Global Virtual Conference on Swine Health. INTERNET. May 29- June 5, 2001.
7.5.2 Parma A.E.
Conferencia: Prevalencia y
características genotipícas de Escherichia coli verotoxigénicos aislados
del ganado bovino y alimentos cárneos. En Mesa redonda: Zoonosis transmitidas
por alimentos. III Congr. Argentino de
Zoonosis y II Congr. Latinoamericano de Zoonosis, Bs As, Agosto 7-10, 2001. No se editó la conferencia.
7.5.3 Padola N.L., Sanz M.E., Etcheverría A.I., Lucchesi P.M.,
Arroyo G.H., Parma A.E.
Aislamiento de Escherichia coli O157 en bovinos de un
feedlot de la Pcia. de Bs As. Estudio de sus
características feno-genotípicas. II Congr. Argentino de Zoonosis y II
Congr. Latinoamericano de Zoonosis, Bs As, Agosto 7-10, 2001.
7.5.4 Molina P.M., Sanz M.E. y Parma A.E.
Sensibilidad al estres acido de cepas autóctonas de Escherichia
coli enterohemorrágico (EHEC). IX
Congreso Arg. de Microbiol., Bs. As., Octubre 7-11, 2001.
7.5.5 Padola N.L. Etcheverría N.L.,
Sanz M.E., Arroyo G.H., Blanco J.E., Blanco J., Blanco M. and Parma A.E.
Nuevos serogrupos de Escherichia
coli verocitotoxigénicos aislados de un feedlot de Argentina. IX Congreso
Arg. de Microbiol., Bs As., Octubre 7-11, 2001.
Parma A.E.
Panelista en Mesa Redonda:
“Epidemiología del Síndrome Urémico Hemolítico” Tema: Escherichia coli y reservorios naturales.
2das. Jornadas de Epidemiología, Sociedad Argentina de Pediatría. Bs As. Junio
28 y 29, 2002. No se editó conferencia.
7.5.6 Molina, P., Sanz M.
y Parma A. Growth inhibition of Shiga toxin-producing Escherichia
coli (STEC) by organic acids. XXXVIII Reunión Anual de SAIB 2002.
Villa Carlos Paz, 5 al 9 de noviembre, 2002 (poster)
7.6.
INFORMES
Y MEMORIAS TECNICAS.
Informe parcial de avance Foncyt
(subsidio PICT): aprobado.
Informe Carrera de Investigador CIC 1999-2000: aprobado.
8.
TRABAJOS
DE DESARROLLO DE TECNOLOGÍAS.
8.1.
DESARROLLOS
TECNOLÓGICOS.
8.2.
No en
este periodo.
8.3.
PATENTES
O EQUIVALENTES.
No existen.
8.4.
OTRAS
ACTIVIDADES TECNOLÓGICAS CUYOS RESULTADOS NO SEAN PUBLICABLES
9.
SERVICIOS
TECNOLÓGICOS.
Circunstancial. Estudios de cepas de
E. coli enterohemorrágica enviadas por investigadores de otras
instituciones. En casi todos los casos: sin cargo.
10.
PUBLICACIONES
Y DESARROLLOS EN:
10.1. DOCENCIA
10.2. DIVULGACIÓN
11. DIRECCION DE BECARIOS Y/O INVESTIGADORES.
Director beca doctoral del Bioq. Pablo Molina,
otorgada por el Foncyt, PICT 9-5115 BID 1201 OC-AR. Codirector: Dr Marcelo E.
Sanz. Tema: Estudio de la sensibilidad al estrés ácido y térmico de cepas autóctonas
de Escherichia coli enterohemorrágicas (2001, 2002 y sigue).
Dirección de investigadores que integran el grupo de
investigación (Dres. Marcelo E. Sanz, Dra Paula A. Lucchesi, M.V. Guillermo H.
Arroyo, M.V. Analía I. Etcheverría, M.V. Nora L. Padola)
12.
DIRECCION DE TESIS.
Director Tesis doctoral del Bioq. Pablo Molina, otorgada por
el Foncyt, PICT 9-5115 BID 1201 OC-AR. Codirector: Dr Marcelo E. Sanz. Tema: Estudio
de la sensibilidad al estrés ácido y térmico de cepas autóctonas de Escherichia
coli enterohemorrágicas. Doctorado en Ciencia Animal. FCV-UNCPBA (2001, 2002
y sigue).
Director de Tesis doctoral de la
M.V. Nora L. Padola, FCV-UNC.Tema: Características feno-genotípicas de Escherichia
coli verotoxigénicos aisladaos de bovinos en feedlot. Doctorado en Ciencia
Animal. FCV-UNCPBA (iniciado en marzo 2001).
13.
PARTICIPACION EN
REUNIONES CIENTIFICAS. Ver en Item “Comunicaciones”.
14.
CURSOS DE
PERFECCIONAMIENTO, VIAJES DE ESTUDIO,
Investigadores y becarios bajo mi dirección han
realizado cursos y pasantías durante este periodo. No personalmente.
15. SUBSIDIOS RECIBIDOS EN EL PERIODO. Indicar
Foncyt PICT 9-5115
BID 1201 OC/AR
Calidad de alimentos: caracterización de factores de
virulencia de Escherichia coli en cárneos y lácteos. Destino:
equipamiento, insumos y beca doctoral. Monto 2 años: $ 90.012.
Secyt-UNICEN. insumos y servicios no personales $
12.131.
16.
DISTINCIONES O PREMIOS
OBTENIDOS EN EL PERIODO.
Premio “Vilfrid Baron” otorgado en Nov. 2001 por la
Academia Nacional de Veterinaria al mejor trabajo a nivel nacional vinculado
con la sanidad animal y calidad de alimentos. Otorgado al grupo de
investigación.
17.
ACTUACION EN ORGANISMOS
DE PLANEAMIENTO, PROMOCION O EJECUCION CIENTIFICA Y TECNOLÓGICA.
Integrante de la Junta de Calificación para Carrera de
Investigador CIC (1%)
Miembro de la Comisión Asesora del doctorado en
Ciencia Animal. Fac. Cs. Vet. Univ. Nac. del
Centro (2%)
Evaluador de Ingreso y Promociones a Carrera de
Investigador del CONICET (0.5%
Evaluador de Informes del Programa de Incentivos
(0.5%)
Presidente de la Comisión de Pertinencia del Foncyt
(1%)
Codirector del Núcleo consolidado SAMP (asociado a
CIC)
18.
TAREAS DOCENTES
DESARROLLADAS EN EL PERIODO.
Docente en el curso de grado Inmunología básica. 5%
Docente en el curso de grado Inmunología especial. 5%
Docente en el curso de posgrado Biotecnología molecular (15 días
intensivo, 2001). 5%
19.
OTROS ELEMENTOS DE
JUICIO NO CONTEMPLADOS EN LOS TITULOS ANTERIORES.
20.
TITULO Y PLAN DE TRABAJO
A REALIZAR EN EL PROXIMO PERIODO.
ESCHERICHIA COLI VEROCITOTOXIGENICA
Objetivos:
-Generales:
Debido a la patogenicidad y morbilidad de Escherichia coli verocitotoxigénica (VTEC) para el hombre, y especialmente para la población infantil, y conociendo:
i) la elevada incidencia del síndrome urémico hemolítico (SUH) y colitis hemorrágica (CH) en nuestro país,
ii) que el ganado bovino es reservorio de diversos serotipos VTEC en Argentina, según investigaciones realizadas en nuestro Laboratorio,
iii) que los alimentos cárneos de origen bovino resultan contaminados y llevan el microorganismo hasta el hombre,
en este proyecto nos proponemos investigar la participación en la cadena epidemiológica del SUH de las cepas aisladas de bovinos alimentados a corral (feedlot) y en pradera, sus marcadores de virulencia y su resistencia a distintos factores físicos, químicos y biológicos.
-Específicos:
i) Estudiar la presencia de VTEC en animales con distintos sistemas de alimentación.
ii) Caracterizar por técnicas de biología molecular sus genes de virulencia (vt1, vt2, eaeA, plásmido de 60MDa) y determinar los serotipos.
iii) Estudiar polimorfismos en sus genes de virulencia.
iv) Aislar bacterias probióticas que inhiban el desarrollo de VTEC.
v) Determinar la resistencia al estrés ambiental (ácido y térmico) de cepas VTEC autóctonas.
La infección con VTEC se da por consumo de agua o alimentos contaminados, transmisión persona-persona o contacto directo con bovinos o con su materia fecal (Tarr, 1995). Una manera de reducir el riesgo de infecciones por EHEC en el hombre sería disminuir el nivel de colonización de EHEC en bovinos (Dean-Nystrom y cols., 1999). Doyle M.P. recomienda tres estrategias para reducir la carga de patógenos en los animales para consumo:
·
exclusión competitiva
·
manipulación de
factores de la dieta
·
desarrollo de nuevas
vacunas.
Dentro de ellas, la exclusión competitiva implica alterar o aumentar la microflora normal de animales destinados a consumo, empleando bacterias probióticas (Loper, 1999).
Los probióticos son microorganismos que, ingeridos vivos, afectan en forma beneficiosa al huésped mejorando el balance microbiano, eliminando o reduciendo microorganismos peligrosos (Fuller, 1992). Para ser considerados como probióticos, los microorganismos deben presentar ciertas características como:
*tolerancia a la bilis
*resistencia a la acidez
*capacidad de estabilizar la microflora
intestinal
*poseeer tiempo de generación corto
*no presentar propiedades patogénicas
*estimular la respuesta inmunitaria
*adherencia a tejidos epiteliales del
huésped
*antagonismo con microorganismos potencialmente patógenos, ya sea por exclusión competitiva, agregación bacteriana o producción de sustancias antimicrobianas (ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, colicinas) (Lindgren y Dobrogosz, 1990; Klaenhammer, 1993; Spencer y Chesson, 1994; Goldin, 1998; Dunne y cols., 1999).
Las cepas para ser seleccionadas como probióticos deben provenir de la misma especie animal en la cual ejercerán su función y sobrevivir y crecer en su respectivo nicho ecológico (Nemcová, 1997).
Varias cepas de E. coli pueden producir diferentes colicinas (ColE1 a ColE8, K, N, ColG, ColH y Mcc B17) que son inhibitorias in vitro para E.coli productoras de diarrea, incluyendo O157:H7 (Bradley y cols., 1991; Murinda y cols., 1996). Las colicinas pueden ser uno de los varios metabolitos producidos por las bacterias probióticas en el rumen y otras secciones del tracto digestivo (Zhao y cols., 1998). El tratamiento de los bovinos con probióticos podría reducir el nivel de colonización y la eliminación fecal de VTEC disminuyendo de esta manera la contaminación ambiental con este patógeno.
Nuestro grupo ha establecido contactos con investigadores del CERELA (Tucumán), con amplia experiencia en microorganismos probióticos, con el propósito de desarrollar algunos aspectos aplicados al control de VTEC.
Por otro lado, se ha estudiado la sobrevida de O157:H7 en condiciones desfavorables tales como el estrés ácido, térmico y por etanol (Lin y cols., 1995; Jordan y cols., 1999; Duffy y cols., 1999) pero se desconoce el comportamiento de cepas autóctonas no-O157:H7 aisladas de reservorios, alimentos y casos clínicos.
Continuando con lo realizado en años previos e incentivado por el Premio Vilfrid Baron de la Academia Nacional de Agronomía y Veterinaria 2001, nuestro grupo propone este plan polifacético con un objetivo convergente: el control de E. coli verocitotoxigénica dado el alto índice de prevalencia de síndrome urémico hemolítico en Argentina y en particular, provincia de Buenos Aires.
Metodología:
Aislamiento y procesamiento de las bacterias:
Toma de muestras de materia fecal de bovinos por hisopado rectal y posterior siembra en placas de agar Mac Conkey. Siembra de una alícuota de la zona de crecimiento confluente en caldo Luria Bertani (LB) y posterior lisis celular para la liberación del ADN.
Identificación de VTEC:
Amplificación por PCR del ADN
obtenido para la detección de genes codificantes de verocitotoxinas: VT1, VT2,
y otros factores de virulencia (gen eae O157) (Woodward y cols., 1992;
Gannon y cols., 1993; Parma y cols., 1996).
Identificación de colonias individuales:
A
partir de las muestras positivas, siembra en placas de agar para el aislamiento
y procesamiento de “pooles” de 5 colonias con morfología característica de Escherichia
coli.
Liberación
del ADN y posterior amplificación por PCR para la detección de genes
codificantes de verocitotoxinas (VT1 y VT2). Aislamiento de la colonia
individual de cada “pool” positivo identificando sus factores de virulencia
(VT1, VT2, eaeA y Mp). Siembra de las colonias individuales en agar Mac
Conkey-Sorbitol (SMAC) para estudiar su capacidad fermentadora.
Serogrupos
no-O157:
Serán
determinados en el Lab. de Referencia de Escherichia coli de la
Universidad de Santiago de Compostela, Lugo, España.
Aislamiento selectivo de O157:
Siembra de una alícuota de las
muestras positivas a eae O157 en agua de peptona con el agregado de
antibióticos (Cefixima, Vancomicina y Cefsulodín). Separación inmunomagnética
de bacterias por el método de perlas microscópicas de poliestireno adsorbidas
con anticuerpos anti-O157 unidos en forma covalente a su superficie
(Dynabeads). Siembra en placas de agar McConckey-Sorbitol-Telurito-Cefixima.
Recuperación de colonias sorbitol negativas para obtención del ADN por lisis
celular en caliente. Amplificación del ADN obtenido mediante la técnica de PCR,
para detección de verocitotoxinas y otros factores de virulencia (eaeA y
Mp).
Ensayo de citotoxicidad en células VERO:
Determinar la producción de VTs y efecto citopatogénico por el
ensayo de citotoxicidad en células Vero en las cepas portadoras de genes
codificantes (Blanco y Blanco, 1993).
Perfiles RAPDs:
Se estudiarán distintos “primers”, seleccionando aquellos que permitan una mayor diferenciación entre cepas a través de los perfiles genéticos que se obtengan (Madico y cols., 1995; Birch y cols., 1996; Pacheco y cols., 1997).
Detección de polimorfismos en genes de virulencia:
En la identificación de variantes de VT2 se utilizará la técnica de PCR, teniendo en cuenta el método de genotipificación desarrollado por Tyler y cols. (1991) y ampliado luego por Piérard y cols. (1998).
Para el estudio de diferencias a nivel de genes eae y saa, emplearemos las metodologías de PCR utilizadas por Oswald y cols. (2000) y Paton y cols. (2001), respectivamente.
Ensayo de producción de colicinas:
Identificación de bacterias productoras de colicinas
Siembra en placas de agar MacConkey de hisopados de colon bovino obtenido en frigorífico. Selección de 12 colonias por placa y siembra por picadura en placas de caldo tripticasa soya con agar.
Inactivación de las bacterias por exposición a vapores de cloroformo. Siembra de LB agar inoculado con bacterias indicadoras ( E.coli O 157 y otros serotipos de EHEC de diferente origen aisladas en nuestro Laboratorio) sobre los cultivos inactivados. Observación de halos de inhibición de crecimiento alrededor de las colonias inactivadas (Blanco y Blanco, 1993; Zhao y cols., 1998).
Identificación de las bacterias seleccionadas:
Identificación por pruebas bioquímicas de las colonias que produjeron inhibición del crecimiento.
Ensayos de
resistencia al estrés ácido, térmico y alcohólico:
Las cepas VTEC aisladas durante el
proyecto serán sometidas a la acción de ácidos minerales y orgánicos. Se
trabajará variando el pH dentro del rango ácido-neutro y ensayando la acción de
distintas molaridades de ácidos orgánicos relacionados a los procesos de
elaboración y conservación de alimentos, además del HCl en concentración
semejante a la existente en el jugo gástrico. Las temperaturas a las que serán
sometidas las bacterias serán las empleadas en los procesos de la industria
alimentaria. Las concentraciones de etanol a emplear guardarán relación con
aquellas encontradas en bebidas tales como cerveza y vino (Benjamin y Datta,
1995; Lin y cols., 1995; Jordan y cols., 1999; Mazzotta, 2001).
Estudios
estadísticos:
El análisis de distribución de
factores de virulencia en los distintos aislamientos se efectuará por el método
de X2 con correcciones de Yates por continuidad.
Plan de
actividades total, estado de avance del proyecto y cronograma futuro:
Obtención
de muestras de bovinos de feedlot (durante los primeros 4 semestres).
Aislamiento
de Escherichia coli en medios selectivos: se realizarán en paralelo a la
obtención de las muestras (durante los primeros 4 semestres).
Obtención
de ADN de las distintas colonias seleccionadas (en paralelo con la actividad
anterior).
Determinación
de los genotipos de virulencia VT1 y VT2 por PCR y análisis de
polimorfismos (durante todo el proyecto, 6 semestres).
Determinación
de otros genes de virulencia (eaeA y megaplásmido) por PCR y análisis de
polimorfismos (durante todo el proyecto, 6 semestres).
Fermentación
de sorbitol: será ensayada sobre las cepas verocitotoxigénicas (4 primeros
semestres).
Determinación
de la expresión de verocitotoxinas en las cepas positivas para el gen
correspondiente (último trimestre de cada año).
Aislamiento
y caracterización de bacterias productoras de colicinas y su acción inhibitoria
del desarrollo de cepas VTEC (durante todo el proyecto: 6 semestres).
Estudio de
la resistencia al estrés ácido y térmico de las cepas virulentas caracterizadas
previamente (durante todo el proyecto: 6 semestres).
Análisis
estadístico de los resultados (último semestre del proyecto).
Difusión
de los resultados parciales: durante cada año por medio de publicaciones y/o
presentaciones en congresos de la especialidad.
Fuentes de
financiamiento:
Se cuenta con financiamiento anual de
SECYT-UNCPBA y un PICT99 del FONCYT. Aspectos previos a este proyecto, mediante
el que se determinó el rol de bovino como reservorio de cepas VTEC, fueron
financiados por FONCYT (PICT0543/96) y CIC.
Referencias
Fueron suprimidas por razones de espacio.